胡 瑾 張曉麗 蘇 華 趙麗敏 趙雪聰 郜 岳

1.河北北方學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北張家口 075000；2.河北北方學院電鏡室，河北張家口 075000；3.河北北方學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，河北張家口 075000

中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病是臨床上較為常見的 一組疾病，在病理上以中樞神經(jīng)系統(tǒng)多灶性脫髓鞘、炎癥為主，病因上與自身免疫相關(guān)的一組臨床疾病，病因復(fù)雜，至今尚未闡明。甘露糖凝集素（mannosebinding lectin，MBL）是人體內(nèi)重要的天然抗感染免疫分子[1]，若MBL發(fā)生基因突變，則會導(dǎo)致缺損或異常，機體對外界病原體的易感性則發(fā)生變化，從而影響先天免疫能力。MBL與炎癥、自身免疫性疾病和抗感染免疫等關(guān)系密切[2-4]。本研究利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析的方法，觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘患者MBL基因第54號密碼子多態(tài)性分布，探討MBL基因多態(tài)性與中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病之間的關(guān)系。現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集 2009年 1月～2012年 12月河北北方學院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）神經(jīng)內(nèi)科患中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病病例45例（疾病組），其中男18例，女 27 例，發(fā)病年齡為 12～72 歲，平均（38.2±2.6）歲。 其診斷按照1983年P(guān)oser提出的診斷標準[5]。對照組為來我院進行體檢的健康人員（健康對照組），共計60例，其中男 38例，女 22例，年齡為 25～65歲，平均（43.6±5.2）歲，無免疫病史和嚴重感染史。本研究經(jīng)我院倫理委員會通過，研究對象知情同意并簽署知情同意書。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 樣本的收集及處理

疾病組在入院當天采集靜脈血，健康對照組在體檢當日抽取靜脈血，均隨機進行編號。采用EDTA-K2抗凝管收集靜脈血。將部分靜脈血放入離心管中進行離心，離心10 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，分離出血漿，放入EP管中，-80℃保存。

另取部分血液采用DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）進行提取備用。即：取1 mL抗凝靜脈血，在樣品中加入3 mL紅細胞裂解液 ，顛倒混勻，室溫放置5 min，期間再顛倒混勻幾次。10 000 r/min離心1 min，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200 μL緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。加入20 μL Proteinase K溶液，混勻。加入200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10 min。加入200 μL無水乙醇，充分震蕩15 s，所得溶液加入吸附柱CB3中，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，向吸附柱 CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心 30 s，倒掉廢液，向吸附柱 CB3中加入 600 μL漂洗液 PW，12 000 r/min離心 30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中，然后置于室溫放置數(shù)分鐘，將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50～200 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.3 方法

采用河北北方學院賈天軍等[6]建立的MBL ExonⅠ54位基因突變檢測方法進行操作。PCR擴增目的DNA：引物：5′-AGGGCATGCTCGG-TAAAT-3′、5′-CTCATATCCCCAGGCAGTT-3′。凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，記錄。

1.4 統(tǒng)計學方法

計算出中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病組和對照組MBL基因的各種基因型頻率和等位基因頻率，使用SPSS 12.0軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，利用卡方檢驗，分析MBL在各組間的差別，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

在所檢測到的45例中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者甘露糖凝集素基因ExonⅠ 54位密碼子點突變中，野生型（GGC/GGC）為 34例，占 75.56%；突變雜合子型（GGC/GAC）為 10例，占 22.22%；突變純合子型（GAC/GAC）為 1例，占 2.22%?；蝾l率：GGC 為86.67%，GAC為13.33%。對照組野生型（GGC/GGC）為30例，占50.00%；突變雜合子型 （GGC/GAC）為28例，占46.67%；突變純合子型（GAC/GAC）為 2例，占3.33%?；蝾l率：GGC為73.33%，GAC為26.67%。兩組基因點突變頻率比較，中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者GGC/GGC基因型頻率增高，而GGC/GAC基因型頻率降低，差異均有顯著性；中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者GGC等位基因頻率高于健康對照組，而GAC等位基因頻率低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病組、健康對照組基因點突變頻率的比較

3 討論

MBL是一種C型凝集素，屬于 Ca2+依賴型凝集素，是一種與先天免疫防御相關(guān)的血清凝集素，廣泛存在于人和動物體內(nèi)。人的MBL基因定位于10號染色體長臂上（10q11.2～q23），長約 7 kb，含有 3 個內(nèi)含子，4個外顯子，cDNA全長約 30 kb，有4個編碼區(qū)，包括mbl1和mbl2兩個基因，但mbl1是一種假基因，mbl2是人們通常說的MBL基因。人的MBL多以二聚物、三聚物和四聚物的形式存在。MBL主要由肝細胞產(chǎn)生，經(jīng)分泌入血，其存在形式有兩種，一是游離存在，另一種是與細胞膜結(jié)合，以膜結(jié)合蛋白形式存在，膜結(jié)合蛋白型廣泛分布于白細胞、枯否細胞、血小板、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等。這種分布形式與MBL的先天免疫反應(yīng)功能有關(guān)。它能夠識別糖配體，啟動補體系統(tǒng)活化系統(tǒng)，促進吞噬、免疫調(diào)節(jié)作用，抑制、中和病毒作用，也是精卵識別的信號受體之一。

MBL作為機體的防御屏障，在保護機體，抵抗致病菌的入侵方面發(fā)揮了重要作用。MBL發(fā)揮免疫防御功能依賴于其在血清中的濃度和四級結(jié)構(gòu)的多聚形式，血清中MBL水平降低將導(dǎo)致機體調(diào)理吞噬功能低下，易患感染性疾病。薛玉瑋等[7]報道在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清MBL水平顯著低于健康志愿者，特別是活動期系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清MBL水平降低尤為明顯，而且血清 MBL水平較低的患者更易發(fā)生比較嚴重的感染。

MBL基因結(jié)構(gòu)區(qū)變異及啟動子區(qū)基因不同的調(diào)節(jié)活性將影響血液循環(huán)中MBL水平，MBL基因點突變導(dǎo)致有功能的MBL分子血清水平大大降低，將導(dǎo)致調(diào)理缺陷，先天性免疫力削弱。機體易遭病原體侵襲；另一方面，其激活補體級聯(lián)反應(yīng)，而補體活化又可能造成自生組織損傷。因此，MBL與臨床許多疾病密切相關(guān)，近年來國內(nèi)外學者研究MBL水平降低與克隆氏病，1、2型糖尿病，呼吸道感染和類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān)[2，4，8-12]。 血清中 MBL含量較低者終生處于高度的感染風險之中，隨時可感染各種疾病，甚至威脅生命。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性、多灶性脫髓鞘為主的自身免疫系統(tǒng)疾病，以反復(fù)發(fā)作，多次緩解、復(fù)發(fā)為特征。嚴重危害人體健康，盡管許多年來國內(nèi)外學者對其進行了大量深入地研究，但其病因及發(fā)病機制迄今仍未闡明。因MBL與自身免疫性疾病中的關(guān)系非常密切，筆者采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）法檢測了45例中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病和60例健康志愿者的MBL基因多態(tài)性的分布，結(jié)果顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病組GGC/GGC基因型頻率增高，而GGC/GAC基因型頻率降低，差異均有顯著性；中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者GGC等位基因頻率高于健康對照組，而GAC等位基因頻率低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明MBL基因突變與中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病發(fā)病有關(guān)，可能是該病發(fā)生的危險因素。

MBL與中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的發(fā)生密切相關(guān)，隨著對MBL的深入研究，對進一步揭示中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的發(fā)病機制將起到積極作用。如何控制血漿中MBL的濃度水平來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘等自身免疫性疾病，這將為攻克這類頑癥提供新的思路。

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