朱彥　楊靖梅　段丁瑜　等

[摘要] 生物膜是黏附在固體表面，包裹在自身產(chǎn)生的胞外多聚基質(zhì)中的細菌群體。生物膜的形成和發(fā)展包括細菌的黏附、繁殖和分散。附著于某表面的生物膜將其中的細菌釋放、分散到周圍環(huán)境以傳播到新的位置形成新的群落即生物膜的分散。生物膜分散是生物膜生長發(fā)展周期中一個重要的階段，起到重要的傳播作用。對許多致病菌而言，生物膜的分散能使生物膜的細菌轉(zhuǎn)化為浮游狀態(tài)，促進感染的擴散。生物膜的形成能提高細菌對抗微生物劑及宿主防御反應(yīng)的抵抗力。在口腔中，口腔微生物能附著于口腔組織及修復(fù)體表面形成生物膜。人類齲病、牙周病是口腔的慢性感染性疾病，它們的發(fā)生與生物膜密切相關(guān)。生物膜分散機制是近年的研究熱點，促進生物膜分散的新制劑可能成為攻克生物膜感染又一靶點。分散物質(zhì)的臨床意義和可能的臨床應(yīng)用具有廣闊的前景。本文對口腔中能促進生物膜分散的分散物質(zhì)作一綜述。

[關(guān)鍵詞] 生物膜； 分散； 口腔微生物

[中圖分類號] R 780.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.023

口腔是一個完整而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)?？谇晃⑸锶河沙^600種細菌、真菌以及病毒組成[1]。這些微生物物種大部分可相互關(guān)聯(lián)并形成生物膜附著于口腔軟硬組織和修復(fù)體表面，是人類常見的口腔疾病如齲病、牙周病的重要始動因子[2]。

生物膜的形成和發(fā)展主要可以分為3個階段，具體如下。1）黏附：細菌黏附定植于某表面；2）成熟：細菌繁殖、生長，并分泌胞外聚合物基質(zhì)，將其包裹其中，形成成熟的生物膜；3）分散：部分細菌從生物膜上脫離，分散到周圍環(huán)境中。與生物膜相關(guān)感染的治療較為困難，其原因在于生物膜中的細菌對抗菌藥物的耐藥性及對人類免疫系統(tǒng)的抵抗性明顯高于游離細菌。另一方面，當(dāng)感染患者機體內(nèi)游離病原菌被殺死清除以后，致病菌能再從生物膜中釋放，形成游離菌，導(dǎo)致感染的反復(fù)發(fā)作[3]。

生物膜分散是生物膜生命周期中非常重要的一步，它使得生物膜中的微生物可以分散并傳播到周圍環(huán)境中形成新的微生物群落，是微生物繁殖的重要途徑。對于致病菌而言，生物膜分散促進了病原菌的傳播，導(dǎo)致感染的擴散。另一方面，胞外多聚基質(zhì)的合成使得生物膜中微生物對宿主防御和抗菌藥物的耐受性增加，而單個浮游狀態(tài)的細菌由于脫離了生物膜這一相對有利的生存環(huán)境，對殺菌劑的敏感性大大提高，有利于細菌的清除。因此生物膜分散同時也可能成為解決生物膜感染難治性的一個有利的切入點。

盡管目前生物膜分散的機制尚未完全明了，但是近年來隨著對生物膜分散研究的逐步深入，影響生物膜分散的因素越來越多地被研究者發(fā)現(xiàn)。本文主要就口腔微生物生物膜分散物質(zhì)的研究進行綜述。

1 分散蛋白B（dispersin B）

伴放線放線桿菌（Actinobacillus actinomycetem-comitans，A. actinomycetemcomitans）為定植于人類口腔中的一種革蘭陰性的兼性厭氧桿菌，是侵襲性牙周炎的主要可疑致病菌[4]。它能形成牢固附著的菌斑生物膜，能抵抗蛋白酶、超聲、洗滌劑等清除作用。體外實驗證實，以生物膜為存在形式的伴放線放線桿菌相較于其游離狀態(tài)時對李斯德林、氯己定、Plax漱口水的殺菌作用的抵抗力大大提高[5]。這也是常規(guī)的牙周治療不能輕易地根除伴放線放線桿菌造成感染的原因之一。

分散蛋白B是由伴放線放線桿菌分泌的一種多糖水解酶，它是目前研究得較多的一種降解生物膜基質(zhì)的酶，能降解聚-N-乙酰氨基葡聚糖（poly-N-acetylglucosamine，PGA）。PGA能調(diào)節(jié)伴放線放線桿菌在物體表面的附著及細胞間的集聚，是生物膜基質(zhì)的重要組成成分，能幫助細菌抵抗抗菌藥物以及吞噬細胞的作用。Kaplan等[6]通過對比伴放線放線桿菌臨床野生菌株及不能分泌分散蛋白B的變異菌株發(fā)現(xiàn)，不能分泌分散蛋白B的變異菌株盡管在形態(tài)學(xué)上與野生菌株大致相同，但變異菌株不能釋放細胞到培養(yǎng)基中。Itoh等[7]將純化的分散蛋白B加入以上變異株的培養(yǎng)基，能夠使變異株形成的生物膜恢復(fù)釋放細菌的能力；在其他能產(chǎn)生PGA的細菌所形成的生物膜中加入純化的分散蛋白B也能導(dǎo)致細菌從生物膜中釋放，進一步證實了分散蛋白B在生物膜分散中的作用。通過對伴放線放線桿菌野生菌株以及變異菌株所形成的菌斑生物膜對比觀察發(fā)現(xiàn)，野生菌株生物膜在成熟過程中其內(nèi)部逐漸形成空腔，空腔內(nèi)缺乏生物膜基質(zhì)多糖，有一層不集聚的浮游細菌沿壁環(huán)繞，空腔在接近生物膜表層時破潰，釋放其中的游離細菌到周圍的環(huán)境中。而變異菌株生物膜內(nèi)雖然也有空腔存在，但卻缺乏環(huán)繞的浮游細菌層，并且不再釋放細菌、發(fā)生分散[8]。

伴放線放線桿菌所形成的生物膜被自身合成的胞外基質(zhì)包裹，基質(zhì)包含有Ⅳ型菌毛、胞外DNA及胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS），PGA是胞外多糖的主要成分。在成熟的生物膜中，EPS可占生物膜總體積數(shù)的90%以上，分散蛋白B作為β-己糖苷酶對EPS中的PGA進行水解，從而導(dǎo)致了缺乏生物膜基質(zhì)多糖的空腔形成，進一步發(fā)生生物膜的分散。

分散蛋白B的另一個作用底物可能是基質(zhì)中的Ⅳ型菌毛，該菌毛與伴放線放線桿菌的黏附能力密切相關(guān)[9]。Ⅳ型菌毛的主要亞單位為菌毛相關(guān)蛋白（fibril-associated protein，F(xiàn)ap）-1，F(xiàn)ap-1蛋白存在翻譯后修飾，可能主要為糖基化作用，這一過程可能有PGA參與，分散蛋白B可通過裂解Fap-1蛋白中的PGA降低細菌之間的黏附作用，從而達到細菌分散的目的。

2 表面蛋白釋放酶（surface-protein-releasing en-

zyme，SPRE）

變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）是人類主要的致齲菌，其在口腔中的定植與齲病的發(fā)生密切相關(guān)。表面蛋白P1（也稱為抗原Ⅰ/Ⅱ、PAc）存在于S. mutans細胞表面，可與唾液糖蛋白結(jié)合，導(dǎo)致細菌集聚；也可與黏附于牙面上的唾液蛋白結(jié)合，從而介導(dǎo)S. mutans與牙面的黏附。S. mutans可分泌一種內(nèi)源性SPRE，能使表面蛋白P1從細胞表面釋放、脫離出來，從而調(diào)控S. mutans生物膜的分散[10]。

Lee等[10]運用改良后的恒化器培養(yǎng)S. mutans，使其在羥磷灰石柱上形成單層的S. mutans生物膜，并通過活細胞計數(shù)判斷生物膜中細胞的分散情況，實驗發(fā)現(xiàn)S. mutans生物膜的分散活動隨著pH的降低而增快，在pH值為5～6時達到最大速度。通過外源性添加SPRE后觀察，恰巧在這個pH范圍內(nèi)，SPRE作用下表面蛋白的釋放速度達到最高峰。進一步研究表明，當(dāng)pH為6，細胞的分散與溫度有密切關(guān)系，在溫度為3 ℃時生物膜的分散率達到最高。這些結(jié)果表明S. mutans的分散也許是一個主動的酶作用的過程。

細菌菌細胞分裂增殖也可引起一定程度上的生物膜分散，當(dāng)位于生物膜最外層表面的菌細胞分裂時，由于其受到的吸引力和黏附力較小，分裂的細胞可能會脫離生物膜的表面分散到周圍環(huán)境中去。Vats等[11]通過運用休眠期的細胞在不給予外力的條件下培養(yǎng)出單層的S. mutans生物膜進行實驗，來排除切應(yīng)力或細胞分裂的因素對細胞分散的影響。實驗證實S. mutans生物膜的分散與溫度相關(guān)，并且外源性加入SPRE能促進其分散，而通過鏈霉蛋白酶或熱處理后的SPRE則失去這一作用。

除了S. mutans以外，在其他一些非口腔細菌中也發(fā)現(xiàn)了許多與生物膜分散有關(guān)的蛋白酶，如惡臭假單胞菌分泌的LapG蛋白酶作用于細胞表面的LapA蛋白從而調(diào)節(jié)生物膜的分散[12]；金黃色葡萄球菌分泌的金屬蛋白酶和Spl絲氨酸蛋白酶也與生物膜的分散有關(guān)[13]。由此可見，蛋白酶與生物膜分散之間有著密切的關(guān)系。目前為止S. mutans所分泌的SPRE作用于表面蛋白P1的確切位點以及SPRE的生化性能并未完全明了，但是其對生物膜分散的作用對于治療口腔中由S. mutans所致的齲病的防治有著重要的研究意義，SPRE有著廣闊的研究空間。

3 透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HAase）

HAase是由中間鏈球菌（Streptococcus interme-dius，S. intermedius）所分泌的可降解葡萄糖胺聚糖透明質(zhì)酸的酶。S. intermedius存在于人類口腔、胃腸道及泌尿系統(tǒng)中，在口腔中主要定植于牙面上的牙菌斑生物膜中，與牙周疾病及種植體周圍炎的發(fā)生有密切關(guān)系[14-15]。透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）是一高分子質(zhì)量多糖，由N-乙酰氨基葡聚糖與葡萄醛酸殘基通過糖苷鍵結(jié)合構(gòu)成，是結(jié)締組織重要的胞外基質(zhì)[16]。在口腔中，HA可在唾液、口腔黏膜上皮及齦溝液中檢測到，唾液和結(jié)締組織中的HA可能作為營養(yǎng)物質(zhì)以及細菌附著的基底物質(zhì)，也可能是生物膜細胞外多聚基質(zhì)的重要組成成分。位于齦溝部位的HAase能通過降解HA，從而破壞牙周組織的完整性，造成牙周組織的破壞以及毒素的擴散?；加旋l炎的年輕成年男性，其病情的嚴重程度與他們唾液中HAase的活性成正相關(guān)關(guān)系。在口腔鏈球菌中，僅有S. intermedius和星座鏈球菌能產(chǎn)生HAase。

Pecharki等[17]通過研究HAase在S. intermedius生物膜形成與分散過程中的作用發(fā)現(xiàn)，在補充了HA的培養(yǎng)基上，HAase失活株形成的生物膜增加了31%，而加入外源性HAase可導(dǎo)致S. intermedius生物膜的分散。認為HAase可能破壞S. intermedius細胞表面配基和生物膜的胞外基質(zhì)，而促進生物膜的分散。為了證實這一觀點，將HAase添加到在補充了HA的培養(yǎng)基中形成的S. intermedius生物膜中，18 h后通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)生物膜的總量大量減少，結(jié)果表明，HA是S. intermedius生物膜胞外結(jié)構(gòu)的重要組成成分。

HAase通過降解HA促進S. intermedius生物膜分散。類似于這種通過降解生物膜附著的基底而促進生物膜分散的分散機制也存在于許多非口腔致病菌中，如腸道病原菌霍亂弧菌合成一種血凝素蛋白酶（hemagglutinin protease，HAP），通過降解腸道上皮細胞表面與霍亂弧菌相連接的受體，從而促進生物膜從腸道上皮脫離、分散[18]。海洋細菌交替假單胞菌和弗尼斯弧菌在動物甲殼表面形成生物膜，分泌甲殼素酶降解甲殼素（又稱幾丁質(zhì)、殼多糖）獲得營養(yǎng)，并使生物膜得以分散[19-20]。

4 脂肪酸（fatty acid）

脂肪酸作為生物膜分散信號分子最早是由Dow等[21]在野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris，X. campestris）中發(fā)現(xiàn)的，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為順-11-甲基-

2-十二碳烯酸，由RpfF基因編碼。脂肪酸通過上調(diào)甘露聚糖內(nèi)切酶降解生物膜基質(zhì)引起X. campestris生物膜分散。Davies等[22]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌（Pseudo-monas aeruginosa，P. aeruginosa）在生長過程中可分泌一種短鏈不飽和脂肪酸順-2-癸烯酸，當(dāng)向P. ae-ruginosa生物膜中外源性加入濃度為2.5 nmol·L-1的順-2-癸烯酸時，能引起生物膜的分散。

白色假絲酵母菌（Saccharomyces albicans）是正常人口腔、胃腸道、呼吸道及陰道黏膜的常見共生菌，在特定條件下造成宿主的感染，為條件性致病菌。白色假絲酵母菌是公認的口腔白斑發(fā)生與癌變的相關(guān)因子，若白斑上皮異常增生病變中發(fā)生白色假絲酵母菌感染，癌變的可能將大為增加。Davies等[22]在實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源性添加1.0～10 mmol·L-1的順-2-癸烯酸，可誘導(dǎo)白色假絲酵母菌生物膜發(fā)生分散。在口腔內(nèi)，研究[23]發(fā)現(xiàn)，S. mutans也能分泌一種類似于脂肪酸的反式-2-癸烯酸，其對白色假絲酵母菌芽管的生長有抑制作用。順-2-癸烯酸也能誘導(dǎo)大腸埃希菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、奇異變形桿菌（proteus mirabilis）、化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）所形成的生物膜的分散。這些結(jié)果表明脂肪酸可能不僅是細菌與細菌之間，甚至可能是細菌與真菌之間的信號分子。

脂肪酸引起生物膜的分散可能是多種因素共同的影響。如脂肪酸對X. campestris生物膜的分散作用是通過上調(diào)甘露聚糖內(nèi)切酶，降解生物膜基質(zhì)而促進其分散。在對嗜麥芽黃桿菌研究的實驗中發(fā)現(xiàn)，添加脂肪酸能增強細菌的活動性。另外有研究者[24]將白色假絲酵母菌分別在沒有添加多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）及添加了濃度為1 mmol·L-1 PUFAs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)后者細胞內(nèi)線粒體膜減少，胞核濃染，說明在添加了PUFAs的培養(yǎng)基中的白色假絲酵母菌發(fā)生了凋亡。在對生物膜分散機制的研究發(fā)現(xiàn)，細胞的凋亡以及細菌的能動性都可能是導(dǎo)致生物膜分散的因素，因此脂肪酸對生物膜的分散作用可能是由多方面的共同作用引起的。

5 自誘導(dǎo)物-2（autoinducer-2，AI-2）

細菌能夠自發(fā)產(chǎn)生一些化學(xué)信號分子釋放到周圍環(huán)境中，感應(yīng)這些信號分子的濃度可使細菌獲知周圍細菌的密度，通過感知菌群密度的變化從而調(diào)控特定基因的表達，調(diào)節(jié)細菌群體的一些行為，如生物發(fā)光、毒力基因的表達、生物膜形成等，這種調(diào)控機制稱為細菌的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[25]。

AI-2是細菌的非特異性群體感應(yīng)信號分子，其產(chǎn)生依賴LuxS蛋白，結(jié)構(gòu)為呋喃硼酸二酯，在革蘭陽性和革蘭陰性菌中廣泛存在，被看作是細菌種間的QS信號分子[26-27]?；魜y弧菌缺乏AI-2的變異株能形成更厚的生物膜，且分散速率降低[28]。表皮葡萄球菌luxS基因變異株較野生株生物膜形成量增加，且胞外多糖合成也明顯增多[29]。

口腔中，AI-2已在格氏鏈球菌（Streptococcus gordonii，S. gordonii）、牙齦卟啉單胞菌（Porphyro-monas gingivalis，P. gingivalis）、S. mutans及伴放線放線桿菌中被檢測到。在對口腔細菌的luxS系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，S. mutans及伴放線放線桿菌的luxS缺陷株所形成的生物膜量均變少；在外觀上，S. mutans的luxS缺陷株形成的生物膜粗糙、稀薄，而野生株生物膜均勻、平滑且連續(xù)，并且luxS缺陷株對去垢劑和抗生素的抵抗力明顯高于野生株[30-32]。加入AI-2抑制劑鹵代呋喃酮可抑制口腔中S. mutans、S. inter-medius、咽峽炎鏈球菌（Streptococcus anginosus）的生物膜生長[33]；S. gordonii與P. gingivalis的luxS缺陷株兩者無法像野生株那樣形成共生生物膜，而當(dāng)導(dǎo)入帶有l(wèi)uxS基因的質(zhì)粒后，兩者恢復(fù)形成共生生物膜的能力[34]。

Roy等[35]運用AI-2類似物研究AI-2在大腸埃希菌以及P. aeruginosa生物膜形成與分散中的影響發(fā)現(xiàn)，在生物膜生長過程中持續(xù)加入AI-2類似物會抑制生物膜的發(fā)展。與未經(jīng)AI-2類似物處理的對照組相比，對照組形成的生物膜更厚且更有序。另外通過將AI-2與接近最低抑菌濃度的慶大霉素聯(lián)合運用于已經(jīng)形成的生物膜，能觀察到接近全部的生物膜被清除。

由此可見，luxS/AI-2系統(tǒng)對不同細菌的生物膜的形成及分散可起到不同的調(diào)控作用，并且能介導(dǎo)共生生物膜中細菌間的相互作用。

6 展望

細菌在環(huán)境中有兩種存在形式，一種是以浮游狀態(tài)存在，為單個或少量聚集的細菌團塊；一種以生物膜的狀態(tài)存在，由細菌附著于有生命或無生命物體的表面形成，并被自身分泌的胞外多聚基質(zhì)包裹。以生物膜為存在形式的微生物對抗菌藥物及人體自身免疫系統(tǒng)抵抗力大大提高，細菌釋放毒性刺激機體產(chǎn)生大量特異性抗體及細胞因子，這些免疫成分被生物膜胞外基質(zhì)阻擋，不能滲入生物膜內(nèi)而在感染局部形成免疫復(fù)合物，損傷人體自身組織，加重炎癥破壞。一方面，生物膜的分散可以使細菌從生物膜中釋放，在新的位置形成新的菌落，使感染在宿主體內(nèi)、宿主之間擴散。另一方面，分散的細菌脫離了生物膜這一保護環(huán)境后，對抗菌藥物以及人體免疫系統(tǒng)的抵抗力降低，有利于抗菌藥物和人體吞噬細胞對它們的清除。

近年來關(guān)于生物膜分散的研究越來越多，人們期望通過認識生物膜分散的機制、影響生物膜分散的因素，尋求解決生物膜感染這一難題的新思路。浮游菌較生物膜內(nèi)細菌對抗菌藥物的敏感性高，生物膜分散可能會使抗菌藥更有效地發(fā)揮作用。一些生物膜分散劑，如基質(zhì)降解酶、群體感應(yīng)信號分子、表面活性劑以及鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑都有可能成為抗生物膜感染的重要武器。Darouiche等[36]將分散蛋白B與三氯生聯(lián)合運用于中心靜脈導(dǎo)管感染，起到了強大的抗菌和抗微生物膜的效用。Izano等[37]測試使用0.01%陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）對伴放線放線桿菌生物膜的殺菌作用，通過對比伴放線放線桿菌在3組分別經(jīng)過磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）；分散蛋白B預(yù)處理5或30 min，然后再使用SDS處理5 min，計算試管中的菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過分散蛋白B預(yù)處理后，SDS可使CFU數(shù)量明顯下降。因此，盡管生物膜的分散一方面會促進細菌的分散和傳播；另一方面，在臨床上可以運用生物膜分散物質(zhì)與抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用，控制細菌生物膜感染。生物膜分散物質(zhì)具有巨大的臨床應(yīng)用前景。

齲病和牙周病是人類最常見的兩類口腔疾病，它們的發(fā)生都與牙菌斑生物膜密切相關(guān)。通過生物膜的分散，減少細菌在口腔軟硬組織或修復(fù)體表面的附著，降低細菌對抗菌藥物的耐受性，增強口腔內(nèi)生物膜的清除能力，可能成為齲病與牙周病治療的新方法。目前對生物膜分散的研究大多還處于體外實驗階段，并且多是對單一細菌生物膜的研究，相信隨著研究的深入，必將給由生物膜感染造成的口腔或人體其他部位疾病的治療帶來更多新的思路和方法。

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（本文編輯 杜冰）