徐倩　馮青　歐俊　等

[摘要] 目的 構建一種長效、靶向的攜帶促骨形成藥物HU-308的藥物緩釋種植體，觀察其體外緩釋特性。方法 采用層層靜電自組裝技術制備不同層數(shù)的肝素/殼聚糖涂層，以物理吸附的方式裝載促骨形成藥物HU-308，構建載藥種植并進行體外釋放實驗。通過紫外可見光分光光度計測定藥物濃度，分析不同涂層數(shù)載藥種植體的加載效率及釋放規(guī)律。用掃描電鏡、原子力顯微鏡觀察涂層表面形貌和結構的變化。結果 成功地制備了載HU-308涂層種植體。體外釋放實驗表明，隨著涂層層數(shù)的增加，載藥量逐漸增加，但T20組略有下降。隨著層數(shù)的增加，HU-308的釋放速度隨之減緩，緩釋能力增強。掃描電鏡、原子力顯微鏡結果表明種植體表面肝素/殼聚糖涂層逐漸形成。結論 層層靜電自組裝技術成功構建載有HU-308的涂層種植體，可長期有效釋放達30 d以上，這有望為臨床上提高骨質(zhì)疏松癥患者種植體骨整合率提供一種新的可能。

[關鍵詞] 鈦種植體； 藥物緩釋； HU-308； 層層靜電自組裝； 肝素； 殼聚糖

[中圖分類號] R 783.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.002

骨質(zhì)疏松癥作為一種全身系統(tǒng)性疾病，影響了頜骨的骨質(zhì)量和骨密度[1]，進而影響了頜骨種植體的成功率，如何提高骨質(zhì)疏松癥患者的種植成功率一直以來都是人們關注的焦點。傳統(tǒng)的全身給藥不僅用藥量大、有不良反應且作用于種植體局部的效果不佳。純鈦作為牙種植材料，有著良好的機械性能和生物相容性，但其屬于惰性材料，缺乏生物活性，無骨誘導和骨傳導能力且植入后愈合周期長[2]；因此，很多學者開始研究對種植體表面進行處理，嘗試在種植體局部載藥來解決這些問題。層層靜電自組裝技術（layer-by-layer electrostatic self-assembly，LBL）[3]是基于聚電解質(zhì)陰陽離子所帶正負電荷間相互作用的一種自組裝超分子技術。其原理[4]是分子靜電自組裝，通過靜電力的作用依次吸附上帶異種電荷的聚電解質(zhì)，交替沉積形成自組裝多層涂層，而同時電荷間的排斥力又使每一層的吸附量不會無限增加，而是在一定時間內(nèi)達到飽和。本實驗的研究目的在于構建一種肝素（heparin，Hep）/殼聚糖（chitosan，Chi）涂層種植體，并裝載促骨形成藥物HU-308，使其在種植體周圍形成較高藥物濃度的同時亦可進行緩慢持久的釋放，以誘導種植體周圍成骨細胞的分化，促進新骨的形成，以期為今后提高骨質(zhì)疏松患者的種植骨整合率提供一種新的可能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

商業(yè)純鈦微種植體，直徑2 mm，長4 mm（TA2，純度99.9%，陜西寶雞力華公司）。多聚左旋賴氨酸（Sigma公司，美國），肝素鈉（上海國藥集團化學試劑有限公司），殼聚糖（浙江澳興生物科技有限公司），HU-308（Cayman公司，美國）。

雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司），掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）（VEGA3，TESCAN公司，捷克），原子力顯微鏡（atomic force micros-cope，AFM）（Ntmdt公司，俄羅斯）。

1.2 鈦種植體的堿熱水處理

取50顆鈦種植體依次置于丙酮-無水乙醇-去離子水中超聲清洗，40 ℃干燥。再浸入5 mol·L-1的NaOH溶液中80 ℃活化24 h，然后使用去離子水超聲清洗

3次，每次10 min。接著將堿處理后的鈦種植體浸入60 ℃去離子水中陳化24 h，用去離子水超聲清洗，40 ℃干燥備用。

1.3 肝素/殼聚糖涂層的制備及分組

將殼聚糖在1%乙酸中溶解，制成pH=4、質(zhì)量濃度為5 g·L-1的聚陽離子溶液；肝素溶解在去離子水中，制成pH=4、質(zhì)量濃度為5 g·L-1的聚陰離子溶液；多聚左旋賴氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，制成pH=7.2、質(zhì)量濃度為2.5 g·L-1的聚陽離子溶液。將堿熱水處理過后的樣品浸入PLL溶液中30 min，獲得一個穩(wěn)定的帶正電的前驅(qū)體層，為LBL[3]自組裝程序的初始層，去離子水漂洗5 min，氮氣吹干；再將樣品依次浸入肝素、殼聚糖溶液中，每次浸泡10 min，去離子水漂洗1 min，氮氣吹干。重復上述循環(huán)n次即可得到最終所要求的自組裝涂層Ti/PLL/（Hep/Chi）n，每次循環(huán)最后一層以殼聚糖層終止。

本實驗中50顆鈦種植體平均分為5組： T0組（對照組、無涂層）、T5組（5層涂層）、T10組（10層涂層）、T15組（15層涂層）、T20組（20層涂層），每組10顆。按照上述方法制備所需涂層種植體，室溫干燥后待用。

1.4 HU-308標準曲線的制作

1.4.1 HU-308吸收標準曲線 將乙醇和PBS按1︰2的比例混合配制成標準的稀釋溶劑。然后取一定量的HU-308溶于標準的稀釋溶劑中，分別配制成0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8 g·L-1的一系列梯度濃度的標準液，不含藥物的溶液作為空白對照，采用紫外分光光度計測定所配標準溶液在233 nm波長處的光密度值（A值），以A值對濃度C進行回歸，獲得回歸方程A=8.914 3C+0.031 4，R?=

0.999 2。

1.4.2 HU-308釋放標準曲線 釋放標準曲線的制備方法同吸收曲線，釋放溶劑為pH=7.2的PBS緩沖溶液。用同樣的方式配制一系列梯度濃度的標準液，紫外分光光度計在233 nm波長處測定A值，以A值對濃度C進行回歸，獲得回歸方程A=4.138 8C-0.027 9，R?=

0.999 1。

1.5 HU-308的裝載

將各組鈦種植體浸沒于促骨形成藥物HU-308溶液中，常溫下靜置，利用物理吸附法負載藥物，間隔一定時間取出部分溶液用紫外分光光度計于選定波長處測定其光密度值，直至光密度值無明顯變化時停止測量。對照HU-308吸收標準曲線計算出HU-

308的濃度。

1.6 HU-308體外釋放實驗

常溫下配制釋放介質(zhì)PBS緩沖溶液，pH值為7.2。將裝載有HU-308的鈦種植體浸沒到1 mL的PBS緩沖溶液中進行藥物體外釋放實驗，36.5 ℃±0.5 ℃、50 r·min-1 轉速的水浴環(huán)境下，分別于1～30 d中每隔2 d定時取樣，并更換等量PBS溶液1 mL，用紫外分光光度計測量每個時段樣品溶液在233 nm處的紫外光密度值，直到無藥物釋放為止。對照藥物釋放標準曲線得出每個時點樣品濃度C，可以計算出每個時段下的累積釋放百分率，繪制累積釋放藥物質(zhì)量百分率-時間的藥物體外釋放曲線，從而分析自組裝層數(shù)對釋藥行為的影響。

1.7 表面形貌觀察

從每組鈦種植體中隨機抽取2顆，分別用作SEM和AFM觀察。對堿處理以及涂層改性后純鈦種植體表面進行表征，觀察鈦種植體表面微觀形貌結構的變化。

2 結果

2.1 各組鈦種植體HU-308裝載量

T0、T5、T10、T15、T20組鈦種植體的平均載藥量分別為0.140 2、0.163 8、0.164 6、0.167 2、0.164 1 mg；載藥百分比分別為61.40%、71.72%、72.09%、73.22%、71.87%。隨著涂層層數(shù)的不斷增加，T0至T15組載藥量逐漸增加，但T20組有輕微下降。T0組與實驗各組之間載藥量差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），T5、T10、T20組間載藥量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），T15組與其他組載藥量差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 HU-308的體外釋藥實驗結果

HU-308的釋放曲線見圖1。由圖1可見，各組均為逐漸上升的曲線。當釋放第1天時，對照組T0組即表現(xiàn)出明顯的藥物突釋現(xiàn)象，釋放出藥物總量的28.22%；T5、T10、T15、T20組分別釋放出藥物總量的19.24%、17.29%、15.46%、11.36%。當釋放第2天時，T0組已累積釋放超過50%的藥量，而T5、T10、T15、T20組釋放出50%藥物的時間分別是4、8、12、14 d。隨著鈦種植體涂層層數(shù)的增加，早期突釋現(xiàn)象逐漸減弱。T0組在第10天時已經(jīng)釋放出載藥總量的95.93%，然而T20組30 d的累積釋放量僅是總量的64.93%，且仍有藥物釋出的跡象。由此可見，隨著涂層數(shù)的不斷增加，HU-308的釋放速度隨之減緩，緩釋能力不斷增強。

圖 1 HU-308累計釋放曲線

Fig 1 Cumulative percentage release profile of HU-308

2.3 鈦種植體表面形貌和顯微結構

2.3.1 SEM下觀察 3組不同層數(shù)涂層種植體的表面形貌見圖2。SEM（10 000倍）下可見：堿處理后的T0組種植體表面形成多孔，孔隙大小約為微米到亞微米級（圖2左）；隨著涂層層數(shù)的增加，表面多孔結構逐漸消失，鈦種植體表面逐漸被層層覆蓋（圖2中），當組裝到20個循環(huán)時種植體表面已被完全覆蓋，原凹凸不平的表面已逐漸均勻、平整（圖2右）。

2.3.2 AFM下觀察 用AFM觀察涂層種植體表面微觀形貌，輕敲模式下隨機選擇10 μm×10 μm的微范圍進行圖像采集。AFM二維圖片顯示：NaOH處理后鈦種植體表面是由卵圓形和圓形顆粒組成；隨著涂層層數(shù)的增加，卵圓形顆粒集聚重疊，種植體表面越來越平滑（圖3）。從AFM三維立體圖可見，隨著層數(shù)的增加，堿處理后所形成的島狀/球形排列的粗糙突起逐漸平滑、均勻（圖4）。AFM測得T0、T10、T20的鈦種植體表面微觀粗糙度分別為（102.72±1.3）、（71.87±1.7）、（45.20±0.9） nm，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

本實驗利用靜電的相互作用，在鈦種植體表面交替吸附聚陰離子肝素與聚陽離子殼聚糖，所形成的涂層比普通的物理吸附更加穩(wěn)定[5]；而實驗前期對鈦種植體的堿熱水陳化處理可以使種植體表面形成均勻、多孔的結構，從而增加了表面親水性和電荷密度，形成富含羥基的活性表面[6-8]，可以組裝更多的聚電解質(zhì)，有利于涂層與種植體的結合，使肝素/殼聚糖涂層能夠良好的吸附于鈦種植體表面。

涂層的層數(shù)與藥物的裝載量及釋放能力有關。Haidar等[9]利用層層靜電自主裝技術包覆生物大分子藥物，交替沉積的藻酸鹽/殼聚糖多層膜提高了聚電解質(zhì)穩(wěn)定性從而增強了藥物裝載率。Ye等[10]將殼聚糖和海藻酸鈉層包覆吲哚美辛緩釋藥物，結果表明聚電解質(zhì)層數(shù)和微膠囊緩釋性能有關。有學者制備了不同涂層的殼聚糖乙酸鹽/葡聚糖硫酸鈉涂層來裝載布洛芬，并在PBS溶液和HCl溶液中進行釋放，研究得出涂層厚度與組裝量成正比，當層數(shù)增加時，涂層厚度增加，布洛芬釋放速率減慢。為了研究二者之間的關系，本實驗通過改變肝素/殼聚糖涂層的層數(shù)來觀察其對藥物裝載和釋放的能力。選擇HU-

308作為本研究的加載藥物，HU-308是一種特殊的CB2大麻素受體激動劑，它通過激活不同分化能力的成骨細胞和抑制破骨細胞的形成來維持正常的骨量和骨密度[11-13]。本實驗通過LBL技術構建肝素/殼聚糖生物活性涂層，并用物理吸附的方式將HU-308負載至種植體表面，涂層表面的層狀水凝膠結構可使藥物富集形成局部高濃度，從而靶向的將藥物向周圍傳遞，局部的高濃度藥物可以提高治療的有效性，降低系統(tǒng)毒性。從本研究結果可見，T0與實驗各組HU-308裝載量差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這說明肝素/殼聚糖自組裝涂層有利于促骨形成藥物HU-308的吸附和裝載。隨著涂層層數(shù)的不斷增加，T0到T15組載藥量逐漸增加，這與Ye等[10]的研究結果類似；然而當組裝層數(shù)達到20層時，種植體的載藥量卻輕微下降，當自組裝層數(shù)到20層時，過大的分子鏈密度影響了涂層的透過性，部分HU-308分子無法進入，因而T20組HU-308裝載量有所下降。李小燕等[14]亦報道隨著自組裝層數(shù)的增加，增大了分子鏈堆積密度，藥物較難透過緩釋體系膜。

體外釋放實驗顯示T0組在釋放初期突釋現(xiàn)象明顯，當釋放第2天時，T0組已累積釋放超過50%的藥量，在第10天時幾乎已無藥物釋出，釋放量為95.93%。而實驗組則表現(xiàn)出不同程度的緩釋能力，隨著肝素/殼聚糖涂層數(shù)的增加，初期突釋的現(xiàn)象得到緩解，緩釋能力不斷增強，T5、T10、T15、T20組釋放出50%藥物的時間分別是4、8、12、14 d。本研究只測試了藥物釋放30 d的曲線，從釋放曲線可見，T10、T15、T20組均可持續(xù)釋放達30 d之久。破骨細胞吸收期約在骨重建開始后維持1個月的時間，因此若在此階段進行干預，載藥種植體的藥物釋放時間可以滿足需要；然而何種濃度是抑制破骨細胞，促進成骨細胞的最佳濃度，從而最終達到有效提高骨質(zhì)疏松癥患者種植體骨整合的目的，本課題組將在后續(xù)的研究中進一步探索。

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（本文編輯 杜冰）