劉雪梅　羅雪梅　王征　等

摘要為了建立通過直接器官發(fā)生途徑的櫸樹微繁技術(shù)體系，以當年生帶芽莖段為外植體，進行了櫸樹不定芽的直接誘導(dǎo)試驗.結(jié)果表明：適合不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+BA 2.25～4.50 μmol/L，有效芽誘導(dǎo)率達到76～67%；繼代增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+BA 2.25 μmol/L，增殖系數(shù)為5.1；壯苗培養(yǎng)基為MS+BA 2.25 μmol/L+GA3 1.45 μmol/L；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 2.69 μmol/L+活性炭0.1 g·L-1，生根率77.78%，生根數(shù)達4.5條.

關(guān)鍵詞櫸樹；不定芽；直接器官發(fā)生；再生體系

中圖分類號Q943～1文獻標識碼A文章編號1000-2537（2014）02-0017-05

櫸樹（Zelkova schneideriana）不僅是珍貴的闊葉用材樹種[1-2]，也是重要的園林樹種[3].由于過度采伐，我國的野生櫸樹資源已經(jīng)相當匱乏[4].組培快速繁殖技術(shù)能較好地保持母樹的優(yōu)良性狀，繁殖不受外界環(huán)境限制，因此該技術(shù)已經(jīng)在許多植物優(yōu)良品種的工廠化生產(chǎn)中得到應(yīng)用[5-6].櫸樹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究目前還處于初期階段[7]，主要利用莖尖或愈傷組織誘導(dǎo)的方法進行增殖.但是利用莖尖培養(yǎng)的方法，具有繁殖系數(shù)低的缺點[8]，而利用愈傷組織誘導(dǎo)的途徑則后代容易產(chǎn)生變異[9].本文擬建立通過櫸樹外植體直接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽或側(cè)芽的形成，再經(jīng)繼代和增殖培養(yǎng)獲得大量的不定芽，最后誘導(dǎo)生根成苗的櫸樹微繁技術(shù)體系.以期能在保持母樹優(yōu)良特性的前提下，提高不定芽的繁殖系數(shù)，為櫸樹工廠化育苗提供一定的技術(shù)支持.

1材料和方法

1.1試驗材料

供試材料栽植于中南林業(yè)科技大學(xué)校園內(nèi)，外植體為當年生帶芽莖段，采集于選育出的櫸樹黃色品系的優(yōu)樹枝條，見圖1A.

湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報第37卷

第2期

劉雪梅等：直接器官發(fā)生途徑的櫸樹微繁體系建立

1.2試驗方法

1.2.1初代培養(yǎng)基本培養(yǎng)基采用MS，附加不同濃度的BA，共設(shè)6個處理，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)8個插穗，共32個插穗.25 d后統(tǒng)計腋芽萌發(fā)率、有效芽誘導(dǎo)率及芽平均生長高度.

1.2.2繼代培養(yǎng)當初代誘導(dǎo)的不定芽長到1.5 cm左右時，將萌發(fā)的幼芽從基部切下，并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基采用MS，附加了不同濃度的BA和NAA，共設(shè)9個處理（L9（34）），每個處理8個幼苗，重復(fù)4次，25 d后統(tǒng)計芽的增殖率、芽苗總數(shù)及芽苗的平均高度，計算增殖系數(shù).

1.2.3壯苗培養(yǎng)在壯苗培養(yǎng)試驗中，以高1.0 cm左右的不定芽為試驗材料.基本培養(yǎng)基采用MS，附加了不同濃度的BA和GA3，共設(shè)5個處理.每種處理8個幼苗，重復(fù)4次，25 d后觀察芽的生長狀況.

1.2.4生根培養(yǎng)將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的再生苗接種到生根培養(yǎng)基上，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加了不同濃度的NAA和活性碳誘導(dǎo)生根，共設(shè)5個處理.每個處理8個幼苗，重復(fù)4次，25 d后統(tǒng)計平均生根率、平均生根條數(shù)、平均根長及平均莖高.

1.2.5培養(yǎng)條件培養(yǎng)基均附加瓊脂6 g/L，蔗糖30 g·L-1，pH為6.0.以上實驗的培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度25±2 ℃，光照強度1 500 lx，光照時數(shù)14 h·d-1.

2結(jié)果與分析

2.1細胞分裂素BA對櫸樹初代培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)的影響

2.4不同濃度的NAA和活性炭對不定芽生根培養(yǎng)的影響

不同濃度的NAA和活性炭對櫸樹不定芽生根培養(yǎng)的影響見表7.由表7可知，在試驗所選取的濃度中，生根培養(yǎng)基中添加較高濃度的NAA和較低濃度的活性炭有利于櫸樹不定根的誘導(dǎo)和生長.適宜的櫸樹不定芽生根培養(yǎng)基配方為I4，即1/2MS+NAA 2.69 μmol/L+0.1 g·L-1活性炭，生根率77.8%，生根數(shù)達4.5條

3結(jié)論與討論

木本植物器官發(fā)生過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽的誘導(dǎo)和生長發(fā)育起著重要的作用，在直接誘導(dǎo)不定芽的形成時，細胞分裂素應(yīng)高于生長素的用量或只用細胞分裂素.已有研究表明[7-9]，直接誘導(dǎo)櫸樹不定芽形成時，只用細胞分裂素或細胞分裂素高于生長素的用量誘導(dǎo)效果好.因此，在初代培養(yǎng)的實驗設(shè)計中只考慮細胞分裂素對櫸樹帶芽莖段誘導(dǎo)的影響.這與周燕青等[10]對條葉榕的組織培養(yǎng)研究結(jié)果相似.

以當年生帶芽莖段為外植體，建立起了櫸樹外植體通過器官發(fā)生途徑直接誘導(dǎo)形成不定芽或側(cè)芽，再通過誘導(dǎo)生根而成苗的櫸樹微繁技術(shù)體系：最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA 2.25 μmol/L或2.50 μmol/L；最適增殖培養(yǎng)基為MS+BA 2.25 μmol/L；最適壯苗培養(yǎng)基為MS+BA 2.25 μmol/L+GA3 1.45 μmol/L；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 2.69 μmol/L+活性炭0.1 g·L-1.櫸樹不定芽誘導(dǎo)生根的試驗設(shè)計中只選擇了NAA一種生長素，常用的IBA或NAA與IBA混合使用效果是否更好還有待進一步研究.

離體器官發(fā)生方式大致分為直接器官發(fā)生和間接器官發(fā)生2種方式.間接器官發(fā)生途徑再生不定芽的細胞突變率較高，不利于保持原植株的母本優(yōu)良性狀，而直接器官發(fā)生途徑則能很好的保持母本的優(yōu)良特性，而且直接誘導(dǎo)的不定芽與通過愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽相比，前者不僅繁殖周期短，而且不定芽生長速度快[11].這為進一步研究櫸樹工廠化育苗提供了一定的參考.

由于櫸樹是高大的落葉喬木，其組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)要真正應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)還有許多問題需要解決，如外植體的采樣時間和采樣母樹的樹齡是否對不定芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響等等.

參考文獻：

[1]畢波，劉云彩，陳強，等.櫸樹對大氣污染物的凈化能力研究[J].西部林業(yè)科學(xué)， 2011，40（4）：77-79.

[2]JIN X L， HU X J， SUN Y P，et al. Callus induction and plant regeneration from immature embryos of Zelkova sinica Schneid.[J]. Hort Sci， 2012，47（6）：790-792.

[3]金曉玲.櫸樹的生物學(xué)特性和微繁技術(shù)研究[D].長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)， 2003.

[4]汪靈丹，張日清.櫸樹的研究進展[J].廣西林業(yè)科學(xué)， 2005，34（4）：188-191.

[5]DIEGO N D， MONTALBN I A， MONCALEN P. In vitro regeneration of adult Pinus sylvestris L. trees[J]. South Afr J Botany， 2010，76（1）：158-162.

[6]KATSUAKI I， NAOKI T， MANABU K， et al. Tissue culture of two medicinal trees native to Japan[J]. BMC Proceedings， 2011， 5（7）：1-11.

[7]汪靈丹，張日清，金曉玲.大葉櫸頂芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報， 2010，30（6）：75-79.

[8]JIN X L， ZHANG D L， HE P， et al. Invitro plant regeneration of Zelkova schneideriana， an endangered woody species in China， from leaf explants[J]. J Hort Sci Biotech， 2009，84（4）：415-420.

[9]金曉玲，何平.大葉櫸愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)的影響因素[J].中南林學(xué)院學(xué)報， 2003，23（1）：32-36.

[10]周燕青，丁蘭，徐步青，等.不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對條葉榕組織培養(yǎng)的影響[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報， 2013，30（3）：453-458.

[11]王征，金曉玲，劉雪梅，等.杜仲成熟胚器官發(fā)生途徑的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報， 2013，33（6）：79-83.

（編輯王?。?

[2]JIN X L， HU X J， SUN Y P，et al. Callus induction and plant regeneration from immature embryos of Zelkova sinica Schneid.[J]. Hort Sci， 2012，47（6）：790-792.

[3]金曉玲.櫸樹的生物學(xué)特性和微繁技術(shù)研究[D].長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)， 2003.

[4]汪靈丹，張日清.櫸樹的研究進展[J].廣西林業(yè)科學(xué)， 2005，34（4）：188-191.

[5]DIEGO N D， MONTALBN I A， MONCALEN P. In vitro regeneration of adult Pinus sylvestris L. trees[J]. South Afr J Botany， 2010，76（1）：158-162.

[6]KATSUAKI I， NAOKI T， MANABU K， et al. Tissue culture of two medicinal trees native to Japan[J]. BMC Proceedings， 2011， 5（7）：1-11.

[7]汪靈丹，張日清，金曉玲.大葉櫸頂芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報， 2010，30（6）：75-79.

[8]JIN X L， ZHANG D L， HE P， et al. Invitro plant regeneration of Zelkova schneideriana， an endangered woody species in China， from leaf explants[J]. J Hort Sci Biotech， 2009，84（4）：415-420.

[9]金曉玲，何平.大葉櫸愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)的影響因素[J].中南林學(xué)院學(xué)報， 2003，23（1）：32-36.

[10]周燕青，丁蘭，徐步青，等.不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對條葉榕組織培養(yǎng)的影響[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報， 2013，30（3）：453-458.

[11]王征，金曉玲，劉雪梅，等.杜仲成熟胚器官發(fā)生途徑的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報， 2013，33（6）：79-83.

（編輯王?。?

[2]JIN X L， HU X J， SUN Y P，et al. Callus induction and plant regeneration from immature embryos of Zelkova sinica Schneid.[J]. Hort Sci， 2012，47（6）：790-792.

[3]金曉玲.櫸樹的生物學(xué)特性和微繁技術(shù)研究[D].長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)， 2003.

[4]汪靈丹，張日清.櫸樹的研究進展[J].廣西林業(yè)科學(xué)， 2005，34（4）：188-191.

[5]DIEGO N D， MONTALBN I A， MONCALEN P. In vitro regeneration of adult Pinus sylvestris L. trees[J]. South Afr J Botany， 2010，76（1）：158-162.

[6]KATSUAKI I， NAOKI T， MANABU K， et al. Tissue culture of two medicinal trees native to Japan[J]. BMC Proceedings， 2011， 5（7）：1-11.

[7]汪靈丹，張日清，金曉玲.大葉櫸頂芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報， 2010，30（6）：75-79.

[8]JIN X L， ZHANG D L， HE P， et al. Invitro plant regeneration of Zelkova schneideriana， an endangered woody species in China， from leaf explants[J]. J Hort Sci Biotech， 2009，84（4）：415-420.

[9]金曉玲，何平.大葉櫸愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)的影響因素[J].中南林學(xué)院學(xué)報， 2003，23（1）：32-36.

[10]周燕青，丁蘭，徐步青，等.不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對條葉榕組織培養(yǎng)的影響[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報， 2013，30（3）：453-458.

[11]王征，金曉玲，劉雪梅，等.杜仲成熟胚器官發(fā)生途徑的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報， 2013，33（6）：79-83.

（編輯王健）