酸性成纖維細(xì)胞生長因子的分離純化及活性分析

范亞軍+倪秀珍

摘要：以瞬時表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子（aFGF）的豌豆（Pisum sativum L.）為試驗(yàn)材料，提取豌豆中可溶性總蛋白質(zhì)，利用Western blot方法檢測目的蛋白質(zhì)，結(jié)果表明豌豆可成功表達(dá)aFGF；采用肝素親和柱層析法分離目的蛋白aFGF，并用MTT法檢測aFGF的生物學(xué)活性，結(jié)果表明豌豆中表達(dá)的酸性成纖維細(xì)胞生長因子具有促細(xì)胞分裂活性。

關(guān)鍵詞：豌豆（Pisum sativum L.）；酸性成纖維細(xì)胞生長因子；分離；純化；活性

中圖分類號：Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4211-03

Separation， Purification and Bioactivity of Acidic

Fibroblast Growth Factor

FAN Ya-jun， NI Xiu-zhen

（Department of Biology， Changchun Normal University， Changchun 130032， China）

Abstract： The pea（Pisum sativum L.） plants expressing the foreign protein aFGF were used to extract the total soluble proteins. Western blot was performed to identified the aFGF protein. Heparin-affinity chromatography was used to separate and purify the aFGF. The bioactivity of the aFGF purified was analyzed by MTT. The result of western blot confirmed that the exogenous protein aFGF was expressed and purified successfuly from pea plants. The MTT results showed that the pea plants derived aFGF had the mitogentic activity.

Key words： pea（Pisum sativum L.）； aFGF； separation；purification； bioactivity

酸性成纖維細(xì)胞生長因子（Acidic fibroblast growth factor，aFGF）是一種重要的有絲分裂原，在胚胎發(fā)育期間能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖并參與細(xì)胞的遷移與分化[1，2]。有研究表明，aFGF可以通過促進(jìn)潰瘍底部血管增生而使?jié)兊靡钥焖傩迯?fù)，另外在受損的大腦皮質(zhì)中內(nèi)源性的酸性成纖維細(xì)胞生長因子及其受體表達(dá)水平均有提高，這說明aFGF在傷口愈合、神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)及再生過程中具有重要作用[3，4]?；赼FGF在機(jī)體發(fā)育及多種傷病治療中的功能，選擇高效、安全的生產(chǎn)平臺表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子對基礎(chǔ)研究及醫(yī)療方面均具有重要意義，而利用植物作為生產(chǎn)平臺瞬時表達(dá)藥用蛋白質(zhì)是當(dāng)前生物技術(shù)領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)[5-9]，本研究以瞬時表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子的豌豆（Pisum sativum L.）為試驗(yàn)材料，提取植物可溶性總蛋白質(zhì)，利用肝素親和柱層析法分離了外源蛋白質(zhì)aFGF，并對目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性進(jìn)行了分析，為研究酸性成纖維細(xì)胞生長因子提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆種子購買于長春市市場，瞬時表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子的豌豆植株由長春師范大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完成，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH3T3細(xì)胞）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

肝素瓊脂糖凝膠（Heparin SepharoseTM CL-6B）購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，Microcon YM-10超濾管購自美國Millipore公司，蛋白質(zhì)雜交所用二抗-辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中山生物技術(shù)有限公司，低分子量蛋白質(zhì)預(yù)染Marker購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心，化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒Super Singnal West Pico Trial Kit購自Pierce公司，IMDM培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)品aFGF購自美國Sigma-Aldrich公司。

蛋白質(zhì)磷酸鹽（PBS）提取緩沖液配制：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO4、0.27 g KH2PO4、pH 7.4。

1.2 方法

1.2.1 豌豆可溶性總蛋白質(zhì)的提取及檢測 稱取瞬時表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子的豌豆植株0.1 g充分研磨，加入100 μL預(yù)冷的蛋白質(zhì)PBS提取緩沖液于冰上充分溶解蛋白質(zhì)2～3 h，4 ℃ 12 000 r/min離心，得到上清液備用。目的蛋白質(zhì)電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理，用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜于4 ℃過夜反應(yīng)，次日洗膜后加入aFGF抗體（按體積比1∶500稀釋），室溫下輕輕混合90 min后使用PBST（1 L PBS加入2 mL的Tween 20）洗膜，加入用PBST緩沖液稀釋（1∶5 000）的二抗溶液，室溫輕輕混合反應(yīng)1 h后洗膜并進(jìn)行顯色、壓片處理。

1.2.2 目的蛋白質(zhì)的分離純化及蛋白質(zhì)雜交檢測 采用肝素親和層析法分離純化目的蛋白質(zhì)。首先用去離子水多次沖洗層析柱柱體，并用結(jié)合緩沖液（10 mmol/L PBS、0.15 mol/L NaCl，pH 7.4）對柱體進(jìn)行平衡，將豌豆植物蛋白質(zhì)與Heparin SepharoseTM CL-6B混合后置于冰上勻漿混合2 h，將混合后的液體緩慢加入柱中靜置30～40 min后，用10倍體積的結(jié)合緩沖液洗脫雜蛋白，配置不同鹽濃度的PBS緩沖液（0.5、0.8、1.0、1.5 mol/L NaCl）進(jìn)一步洗去雜蛋白，收集洗脫液進(jìn)行電泳并對蛋白質(zhì)進(jìn)行雜交檢測。endprint

1.2.3 目的蛋白質(zhì)的脫鹽處理 將洗脫得到的目的蛋白質(zhì)加入到Microcon YM-10超濾管柱中14 000 r/min離心40 min，并將離心后的Microcon YM-10柱子倒置于新的離心管中加入50 μL PBS緩沖液，1 000 r/min離心10 min得到脫鹽后的目的蛋白質(zhì)。

1.2.4 MTT法檢測目的蛋白質(zhì)aFGF的促細(xì)胞分裂活性 將培養(yǎng)后的NIH3T3細(xì)胞用胰酶消化，并用不含血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104 個/mL，將稀釋后的細(xì)胞均勻加入96孔板，每孔100 μL置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用蛋白質(zhì)PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品aFGF和植物中表達(dá)純化的樣品（aFGF）稀釋成不同濃度梯度（125、250、375、500、625 ng/mL），并以蛋白質(zhì)PBS緩沖液作為陰性對照，將不同濃度aFGF樣品加入培養(yǎng)后的細(xì)胞中，每個梯度4次重復(fù)，加樣后于37 ℃再次培養(yǎng)24 h，次日每孔加入5 mg/mL的外源四甲基偶氮唑鹽（MTT）10 μL，37 ℃培養(yǎng)4～6 h后去掉上清液，加入溶解液二甲基亞砜（DMSO）每孔100 μL，震蕩混勻后于波長570 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的蛋白質(zhì)的提取和鑒定

根據(jù)植物蛋白質(zhì)表達(dá)特點(diǎn)，在接種后12～14 d提取豌豆植株可溶性總蛋白質(zhì)，并對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot檢測，雜交結(jié)果表明目的蛋白質(zhì)酸性成纖維細(xì)胞生長因子在豌豆植株中成功表達(dá)，結(jié)果如圖1所示。

2.2 目的蛋白質(zhì)的分離純化及雜交檢測

研究表明，肝素與酸性成纖維細(xì)胞生長因子能夠特異性結(jié)合[10]。通過肝素親和柱層析法從豌豆植株總蛋白質(zhì)中分離純化目的蛋白質(zhì)aFGF，通過不同鹽濃度的PBS緩沖液洗脫，最終在含1.5 mol/L NaCl的PBS緩沖液中得到目的蛋白質(zhì)，分離結(jié)果如圖2 a所示。通過Western blot方法對所得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，以標(biāo)準(zhǔn)品aFGF為陽性對照，雜交結(jié)果表明從豌豆植株中成功純化出外源蛋白質(zhì)aFGF，結(jié)果如圖2 b所示。

2.3 目的蛋白質(zhì)活性分析

利用MTT法檢測豌豆植株表達(dá)的aFGF的生物學(xué)活性，以aFGF標(biāo)準(zhǔn)品及PBS緩沖液分別作為陽性及陰性對照，結(jié)果表明豌豆植物表達(dá)的aFGF具有明顯的促細(xì)胞分裂活性，在終濃度500 ng/mL時活性最高，結(jié)果如圖3所示。

3 小結(jié)與討論

利用植物系統(tǒng)表達(dá)藥用蛋白質(zhì)具有重要的發(fā)展及應(yīng)用前景。由于植物表達(dá)系統(tǒng)相較于動物及微生物表達(dá)系統(tǒng)具有更高的安全性，因此近年來受到廣泛的關(guān)注，而作為良好的生物反應(yīng)器的基本條件是該體系能夠成功表達(dá)外源蛋白質(zhì)并且能夠保證外源蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。本研究以肝素親和層析法分離純化了豌豆植株中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)aFGF，并對其生物活性進(jìn)行了檢測。肝素是一種黏多糖，可以作為親和柱層析中的吸附劑，研究表明酸性成纖維細(xì)胞生長因子是一種可以與肝素特異性親和的蛋白質(zhì)，當(dāng)豌豆植株可溶性總蛋白質(zhì)與肝素混合后二者發(fā)生特異性結(jié)合，通過不同鹽離子濃度的緩沖液可以將非特異性結(jié)合的雜蛋白質(zhì)洗脫掉[11]。本研究在含1.5 mol/L NaCl的PBS緩沖液中得到目的蛋白質(zhì)，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)混合液在親和柱中靜置的時間是影響目的蛋白質(zhì)洗脫的關(guān)鍵條件，一般靜置30 min左右可得到較高濃度的目的蛋白質(zhì)。

MTT法是檢測細(xì)胞活性常用的一種方法，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源四甲基偶氮唑鹽（MTT）轉(zhuǎn)化成藍(lán)紫色甲瓚顆粒并沉積在細(xì)胞中，二甲基亞砜（DMSO）可將細(xì)胞中的甲瓚顆粒溶解，其吸光度（OD）值與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。酸性成纖維細(xì)胞生長因子具有促細(xì)胞分裂活性，在細(xì)胞中加入aFGF可提高細(xì)胞分裂速度，增加細(xì)胞數(shù)量，利用MTT法可檢測aFGF的促細(xì)胞分裂活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，豌豆植株中表達(dá)的酸性成纖維細(xì)胞生長因子具有促細(xì)胞分裂活性，豌豆是一種良好的表達(dá)藥用蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)器。

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