金納米籠膠囊的制備及其在腫瘤細胞藥物投放中的應(yīng)用

鐘華等

摘要：納米膠囊以其獨特的優(yōu)點，在生物醫(yī)學領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。本工作介紹了一種以金納米籠為核心，內(nèi)部裝載抗癌藥物鹽酸阿霉素（DOX），以功能化的DNA納米材料為外殼并封鎖籠口的新型納米膠囊。這一納米膠囊集細胞熒光成像、藥物靶向投送功能于一體，可通過熒光顯微鏡識別靶細胞（本實驗以人類B淋巴瘤細胞Ramos細胞為研究對象），同時釋放藥物作用于靶細胞，誘導靶細胞凋亡。該納米膠囊的研究為腫瘤細胞的診斷及靶向藥物研究領(lǐng)域提供了一定的理論研究依據(jù)。

關(guān)鍵詞：金納米籠； 淋巴瘤細胞； 脫氧核糖核酸適體； 藥物釋放； 熒光顯微鏡

1引言

納米膠囊是納米材料的一個重要分支[1，2]，目前在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。納米膠囊微小的結(jié)構(gòu)具備優(yōu)良的生物屏障穿透性能，其內(nèi)部空間賦予了它藥物裝載的能力，結(jié)合一些膠囊體的功能化設(shè)計可使之具備藥物可控釋放能力[3]。納米膠囊最重要的應(yīng)用之一是靶向緩釋藥物的開發(fā)[4]。與常規(guī)給藥相比，納米膠囊靶向給藥技術(shù)具備明顯的優(yōu)勢，即納米膠囊可以提高藥物的生物相容性，難溶解于水的特效藥物可通過納米膠囊的裝載來改善其在生物體內(nèi)的吸收能力。目前開發(fā)的藥物約有 40% 是不溶于水的，這大大限制了藥物的應(yīng)用。納米膠囊技術(shù)的出現(xiàn)解決了這個問題。納米膠囊另一個特點是它可直接將藥物運抵靶標病灶并持續(xù)釋放內(nèi)含藥物，維持藥物在病灶的有效濃度[5～7]，提高治療效果的同時降低藥物對人體其它組織或器官的毒副作用[8，9]。這一優(yōu)點解決了普通藥物在吸收及血液運輸過程中容易被分解的難題。因此，納米膠囊的研究成為近年來的熱點話題，目前該領(lǐng)域的研究主要集中在納米膠囊的靶向設(shè)計、膠囊載體優(yōu)化、可控藥物釋放等方面。

金納米籠[10，11]是一種新型納米材料，其制備方法簡單，普通實驗室即可自行合成制備，金納米籠良好的生物相容性使其在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。本研究設(shè)計了一種以金納米籠為內(nèi)核、DNA納米復合結(jié)構(gòu)為外殼的新型納米膠囊，其中空心金納米籠內(nèi)核具備藥物裝載能力，而DNA納米復合結(jié)構(gòu)外殼包含以下幾個功能：其一，可通過其上固載的細胞DNA適體來特異性識別靶標腫瘤細胞，進而將藥物載荷靶向目標；其二，可通過其上設(shè)計的DNA熒光分子開關(guān)實現(xiàn)靶標細胞的高信噪比熒光成像檢測（即具有靶標激活的熒光打開式標記能力，減小了探針本身帶來的熒光背景）。綜上所述，該新型納米膠囊可實現(xiàn)藥物的靶向運輸，可跟蹤藥物的釋放情況（藥物DOX本身有熒光性能，未釋放時存儲在金納米籠內(nèi)部，其熒光信號被屏蔽，隨著釋放發(fā)生DOX本身熒光信號恢復）。本工作設(shè)計的金納米籠膠囊的結(jié)構(gòu)原理如圖1所示。首先，利用金納米籠中空結(jié)構(gòu)裝載抗癌藥物鹽酸阿霉素DOX，同時采用設(shè)計的改良的DNA自組裝網(wǎng)狀納米結(jié)構(gòu)[12]通過硫金鍵共價結(jié)合、堿基配對雜交等作用在金納米籠表面形成密封包裝層，將藥物封存在金納米籠體內(nèi)部，形成載藥納米膠囊。其次，通過對DNA網(wǎng)狀納米結(jié)構(gòu)密封層的功能化設(shè)計，在其中引入腫瘤細胞特異性識別DNA適體片段（DNA S8），賦予了金納米籠膠囊對特定腫瘤細胞的靶向識別能力，使之成為一種靶向藥物投送工具。同時，為了便于清晰地監(jiān)控和跟蹤納米膠囊對特定細胞的識別，在DNA網(wǎng)狀納米結(jié)構(gòu)密封層的設(shè)計中還引入了熒光開關(guān)機制（DNA aptamerFAM/DNABHQ，即綠色熒光素FAM修飾的DNA適體DNA S8，和熒光淬滅基團BHQ修飾的部分互補DNA片段DNA S9，其堿基序列見表 1 中的DNA S8和DNA S9），只有當金納米籠膠囊與特定靶標細胞相遇時，才能引發(fā)DNA適體（DNA S8）對靶標細胞的特異識別反應(yīng)，進而借由競爭反應(yīng)機制使修飾了熒光淬滅團BHQ的DNA片段（DNA S9）從主體結(jié)構(gòu)上脫落下來，恢復DNA適體（DNA S8，一端修飾了綠色熒光素FAM）的綠色熒光，從而實現(xiàn)對靶標細胞的熒光打開式指示。由于熒光開關(guān)機制的引入，降低了背景熒光信號的干擾，使得成像信噪比得到優(yōu)化。由DNA適體介導通過特異性識別作用結(jié)合到靶標細胞表面的金納米籠膠囊，借由細胞內(nèi)吞作用進入靶標細胞內(nèi)部，在細胞內(nèi)吞小泡溶酶體中DNase（脫氧核糖核酸酶）作用下，其表面DNA網(wǎng)狀納米結(jié)構(gòu)密封層外殼逐漸解體，結(jié)構(gòu)變松散，導致裝載的DOX緩慢釋放出來，由于這種藥物本身具有熒光特性，因此釋藥的過程可以通過激光共聚焦顯微鏡雙熒光通道圖片疊加的方式來判斷DOX的釋放程度。本研究設(shè)計的金納米籠膠囊是一種集細胞特異性識別與熒光標記、藥物靶向投送、藥物釋放過程跟蹤功能為一體的新型多功能納米探針，可為靶向載藥系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究提供參考。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

KDC140HR高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；JEOL JEM1200EX透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi公司）；Leica TCS SP5 II 激光共聚焦顯微鏡（德國萊卡公司）；THZ82A氣浴恒溫振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

乙二醇、丙酮、乙醇（煙臺三和化學試劑有限公司）；AgNO3（上海化學試劑有限公司），聚乙烯基吡咯烷酮（阿拉丁試劑），Na2S、NaCl（天津博迪化工股份有限公司），AuClO3（中國國藥化學公司），鹽酸阿霉素DOX（上海生工生物工程有限公司），三（2甲酰乙基）膦酸鹽酸TCEP（SigmaAldrich公司），以上試劑均為分析純。DNA序列購于北京賽百盛生物科技有限公司，堿基序列如表1所示。

2.2銀納米立方體的合成

參考文獻＼[13＼] 制備銀納米立方體：調(diào)節(jié)磁力攪拌油浴鍋的轉(zhuǎn)速為 300 r/min，溫度為 150 ℃。溫度穩(wěn)定后，移取 6 mL 乙二醇于 100 mL 錐形瓶中，蓋上蓋子，攪拌下預熱 1 h。

分別配制含 3 mmol/L Na2S， 0.18 mol/L 聚乙烯基吡咯烷酮和 0.28 mol/L AgNO3的乙二醇溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。1 h 后，在溶液中加入 100 μL Na2S溶液，蓋上蓋子，反應(yīng)8 min，隨后快速加入 1.5 mL 聚乙烯吡咯烷酮和 0.5 mL AgNO3，繼續(xù)反應(yīng) 15 min，觀察顏色由黃色變?yōu)榧t褐色繼而變?yōu)椴煌该鞯幕揖G色后停止反應(yīng)，迅速冷卻至室溫。用丙酮（丙酮體積為反應(yīng)液的一倍）沖洗反應(yīng)液并于 9000 r/min 下離心分離。移去上清液，產(chǎn)物用去離子水超聲重分散并于 10000 r/min下離心分離 30 min，重復3次。將終產(chǎn)物超聲分散到 4 mL 去離子水中，4 ℃ 下密閉避光保存。

2.3金納米籠的合成

合成辦法同樣參考文獻＼[13＼]，金納米籠的生長時間控制稍有不同，具體反應(yīng)時間取決于實驗室環(huán)境，最終反應(yīng)時間以合成產(chǎn)物的紫外吸收數(shù)據(jù)確定。磁攪拌下，取銀納米立方體 100 μL 加入到 5 mL 去離子水溶液（含 1 g/L 聚乙烯基吡咯烷酮）中，加熱至微沸?；亓?0 min后，將 0.1 mmol/L AuClO3溶液用注射泵以 45 mL/h 的速率注入反應(yīng)液中，直至反應(yīng)液紫外吸收峰位于800 nm為止。去除加熱裝置，繼續(xù)回流 30 min直至溶液顏色穩(wěn)定，緩慢冷卻至室溫。反應(yīng)液中加入NaCl至飽和，9000 r/min 下離心30 min，所得沉淀物用二次蒸餾水重分散，隨后 10000 r/min下離心30 min，重復3次。產(chǎn)物超分散于去離子水中，4 ℃下密閉避光保存。

2.4金納米籠膠囊的制備

2.4.1DNA序列S3及S6的預處理[12＼] 將回文DNA序列S3及S6的母液各自加熱到90 ℃，然后程序緩慢降溫（退火），1 h內(nèi)降至18 ℃。最終得到各自的雙鏈結(jié)構(gòu)單元，記為dS3和dS6， 按使用濃度逐級稀釋備用。

2.4.2自組裝雜交法制備DNA納米封裝材料（1） 1 mL 10 μmol/L DNA S1溶液（10 mmol/LPBS緩沖溶液， pH 7.4），與 1 mL 10 μmol/L DNA S2 溶液（10 mmol/L PBS緩沖溶液， pH 7.4）混合，37 ℃雜交反應(yīng)2 h，產(chǎn)物冷藏備用。

（2） 將 1 μmol/L DNA dS3、DNA S4、DNA S5、DNA dS6各1 mL （10 mmol/L PBS緩沖溶液， pH 7.4）加入到（1）中的產(chǎn)物溶液中，18 ℃ 下反應(yīng)24 h。加入1 mL 10 μmol/L DNA S8溶液（10 mmol/L PBS緩沖溶液， pH 7.4），18 ℃ 下反應(yīng)2 h，20000 r/min離心30 min，得到帶Ramos細胞適體末端（DNA S8）的，可用于識別Ramos細胞的DNA納米封裝材料前體。

DNA S8本身帶有綠色熒光素FAM，因此合成的DNA納米封裝材料也帶有綠色熒光，在對目標細胞Ramos識別的過程中與Ramos細胞特異性結(jié)合， 而從DNA納米封裝材料上脫落，使得目標細胞熒光染色。為了降低封裝材料本身的背景熒光信號，本實驗引入一條人工設(shè)計的單鏈DNA S9，它能與DNA S8端頭（含綠色熒光素FAM的一端）部分堿基互補雜交，且其一端修飾了熒光淬滅基團BHQ。DNA S9通過雜交作用組裝到DNA納米封裝材料前體結(jié)構(gòu)上后，BHQ靠近FAM淬滅了其熒光，有效降低了背景熒光。

（3）向（2）中制備好的DNA納米封裝材料前體中加入過量DNA S9，和1 mL （10 mmol/L PBS緩沖溶液， pH 7.4）的DNA S7， 18 ℃ 下反應(yīng)24 h， 20000 r/min下離心30 min，得到最終產(chǎn)物：DNA納米封裝材料。分散到200 μL PBS緩沖溶液（10 mmol/L， pH 7.4）中， 于4 ℃下避光冷藏保存。（DNA S7為輔助DNA結(jié)構(gòu)，其端頭修飾的巰基可以介導DNA納米封裝材料匍匐式地結(jié)合到金納米籠表面，從而形成牢靠的DNA密封結(jié)構(gòu)，防止藥物泄露（設(shè)計原理見圖1）。

2.4.3金納米籠膠囊的制備取200 μL 0.1 μmol/L 鹽酸阿霉素（DOX）加入1 mL 金納米籠中，抽真空濃縮，得到DOX/Au 納米籠溶液。將100 μL 10 mmol/L三（2甲酰乙基）膦酸鹽酸（TCEP）加入1.2 mL 制備好的DNA納米封裝材料（由 10 mmol/L，pH 5.6 的醋酸緩沖溶液配置）中，反應(yīng) 30 min后，加入 1.2 mL DOX/Au 納米籠溶液，18 ℃下避光振蕩反應(yīng) 24 h，得到表面被DNA封裝材料覆蓋密封的DOX/Au納米籠即金納米籠膠囊溶液。在2000 r/min下離心洗滌兩次，所得沉淀重分散于200 μL PBS 緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.4）中，終產(chǎn)物金納米籠膠囊于 4 ℃ 避光保存。

2.5金納米籠膠囊用于Ramos細胞成像

將適量制備好的金納米籠膠囊加入到Ramos細胞中，35 ℃ 下避光孵育30 min。將 10 μL 細胞樣品溶液滴在載玻片上并覆蓋上蓋玻片，蓋玻片周圍用石蠟封閉。 用 Leica TCS SP5 II 激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝Ramos細胞的熒光成像圖。

3結(jié)果與討論

3.1銀納米立方體和金納米籠的結(jié)構(gòu)表征

為了了解銀納米立方體和金納米籠的形貌，對它們分別采用了透射電子顯微鏡（TEM）進行表征，成像結(jié)果如圖2所示。

4結(jié)論

本研究制出一種基于金納米籠內(nèi)核，DNA納米結(jié)構(gòu)密封外殼的核殼結(jié)構(gòu)金納米籠膠囊。此膠囊利用金納米籠中空結(jié)構(gòu)裝載藥物，利用DNA納米結(jié)構(gòu)外殼實現(xiàn)藥物的封裝及膠囊的靶向。此納米膠囊的特點是：（1）依靠DNA納米結(jié)構(gòu)殼上預先設(shè)計的熒光開關(guān)識別系統(tǒng)（熒光DNA適體：DNA aptamerFAM，和與其匹配的熒光淬滅團：DNABHQ）實現(xiàn)對靶標細胞的特異性識別和熒光打開式標記，降低了細胞成像時的背景熒光干擾，同時也將膠囊介導到特定細胞表面；（2）利用中空金納米籠將抗癌藥物輸送到細胞內(nèi)部，并借由脫氧核糖核酸酶降解作用降解DNA納米結(jié)構(gòu)殼，釋放藥物；（3）利用激光共聚焦顯微鏡的多通道成像特性，結(jié)合雙熒光設(shè)計（DNA aptamerFAM，藥物DOX），通過雙通道疊加圖中各區(qū)域色彩變化情況來判斷藥物釋放程度。本工作提出的金納米籠膠囊與同類研究中其它載藥系統(tǒng)如脂質(zhì)體膠囊、去鐵鐵蛋白膠囊等相比主要具有以下優(yōu)點：采用了功能化DNA納米結(jié)構(gòu)外殼設(shè)計，集成了熒光打開式識別結(jié)構(gòu)，在特異性識別靶標細胞的同時，對靶標細胞進行熒光標記，且降低了背景熒光信號。金納米籠膠囊本身能夠提供熒光標記，無需對樣品預染色，簡化了實驗操作。綜上所述，本工作提出的金納米籠膠囊是一種同時具備熒光成像探針和藥物靶向投送功能的新型納米膠囊。利用它成功實現(xiàn)了靶標Ramos細胞的熒光成像和藥物靶向投送及藥物釋放情況跟蹤。本研究為靶向載藥系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究提供了參考。

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