胡燕等

[摘要] 目的 探討索拉非尼聯(lián)合蒽環(huán)類化療藥表阿霉素對乳腺癌MCF-7細胞增殖周期的作用。 方法 細胞做四甲基偶氮唑鹽實驗，繪制細胞增殖曲線。實驗分為4組：對照組、索拉非尼單藥組、表阿霉素單藥組、聯(lián)合組（索拉非尼+表阿霉素）。用聚酰亞胺染色后，經(jīng)流式細胞儀檢測各組細胞增殖周期的變化。 結(jié)果 細胞增殖曲線可見細胞傳代后開始增殖，4～5 d達到峰值，后隨著時間的延長，細胞增殖受抑越來越明顯。流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示，索拉非尼單藥組使MCF-7細胞阻滯于G0/G1期[（62.837±0.511）%]與對照組[（49.250±0.826）%]比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；表阿霉素單藥組使細胞阻滯于S期[（24.976±0.409）%]，與對照組[（23.473±1.009）%]比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；聯(lián)合組G0/G1期細胞比率[（64.373±0.429）%]高于對照組及表阿霉素單藥組[（50.980±0.403）%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 索拉非尼和表阿霉素的聯(lián)合應(yīng)用可以使乳腺癌MCF-7細胞明顯阻滯于G0/G1，可以為乳腺癌的聯(lián)合化療提供一定的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；生物化療；索拉非尼；表阿霉素

[中圖分類號] R979.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）09（c）-0035-04

Affect of the Coadministration of Sorafenib and anthracycline chemotherapy drug on the cell cycle of breast cancer MCF-7 cell

HU Yan WU Bing ZHANG Jun WANG Lianghe GE Wei LUO Rongcheng

Oncology Center， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the affect of Sorafenib combined with anthracycline chemotherapy Epirubicin on the proliferation of breast cancer MCF-7 cell cycle. Methods Cells growth curve were drawn after the MTT experiment. Four different groups were set up： control group， Sorafenib group， EPI group and Sorafenib+EPI （combination） group. The change of cell cycles were detected by PI single staining and flow cytometry. Results Cell growth curve showed， passaged cells began to proliferate， and reached the peak after 4-5 days， with the prolongation of time， cell proliferation was inhibited more and more obvious. The cell cycle by flow cytometry showed that， the Sorafenib group [（62.837±0.511）%] induced G0/G1 phase mitosis arrest， compared with control group [（49.250±0.826）%]， the difference was statistically significant （P < 0.05）； the EPI group （24.976±0.409）%] induced accumulation of S phase mitosis arrest， compared with control group [（23.473±1.009）%]， the difference was statistically significant （P < 0.05）； and the combination group [（64.373±0.429）%] showed greater increase of G0/G1 phase， compared with control group and EPI group [（50.980±0.403）%]， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The combined application of Sorafenib and Epirubicin can make the breast cancer MCF-7 cells arrested in G0/G1， provide certain theoretical basis for the combination chemotherapy for breast cancer.

[Key words] Breast cancer； Biochemotherapy； Sorafenib； Epirubicin

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，占世界所有新發(fā)癌癥的23%，占癌癥總病死率的14%[1]。近期的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的遠期隨訪中，復(fù)發(fā)性乳腺癌的預(yù)后很不理想[2]。目前對于晚期乳腺癌，尤其是性激素受體陰性的乳腺癌，由于缺乏特異性的靶標(biāo)，一直沒有理想的治療方法[3]。傳統(tǒng)化療藥費用昂貴，副作用大，而且容易使乳腺癌產(chǎn)生化療抵抗。細胞周期失控是腫瘤細胞異常增殖的一個重要原因，在腫瘤中發(fā)現(xiàn)有調(diào)控細胞周期進程的Cyclin及細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）基因的異常表達[4]。細胞周期的異常運轉(zhuǎn)是腫瘤細胞惡性增殖的核心環(huán)節(jié)，其中S期的DNA合成和G2/M期的細胞有絲分裂對維持腫瘤細胞的惡性增殖尤為重要。各種抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的生長抑制大都體現(xiàn)在對于細胞周期這兩個時相的調(diào)控上[5]。因此，針對這兩個時相以及相應(yīng)藥物的研究對于了解細胞周期和化療藥的相互關(guān)系起到重要的作用。

索拉非尼是一種小分子多靶點的酪氨酸酶抑制劑，可抑制腫瘤細胞信號傳導(dǎo)，具有良好的抗腫瘤效應(yīng)[6]。索拉非尼抑制細胞周期蛋白及細胞周期的相關(guān)蛋白，使增殖期細胞阻滯在G1期，從而阻斷細胞周期的進展，影響腫瘤細胞的增殖并促腫瘤細胞凋亡[7]。蒽環(huán)類化療藥表阿霉素（epirubicin，EPI）是乳腺癌治療中最為常用和有效的藥物，可明顯改善患者的生存率，在乳腺癌術(shù)后輔助化療及術(shù)前新輔助化療中常用[8]。表阿霉素是一種細胞周期非特異性藥物，能夠直接嵌入腫瘤細胞DNA堿基對之間，從而抑制DNA、RNA的合成。本研究主要探討表阿霉素聯(lián)合索拉非尼對乳腺癌MCF-7細胞增殖周期各時相的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人乳腺癌（MCF-7）細胞株，引自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所。培養(yǎng)傳代于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中（Gibco公司），選擇對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.1.2 藥物及試劑 索拉非尼購于德國拜耳公司，應(yīng)用二甲基亞砜（DMSO）溶解，于-20°保存，實驗用時稀釋，使DMSO終濃度<0.5%，不影響細胞生長。表阿霉素（Epirubicin，EPI）購于江蘇豪森制藥，小牛血清購于天津灝洋生物，四甲基偶氮唑鹽（MTT）及DMSO均購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞生長曲線 將MCF-7細胞以1×104/孔，接種于96孔板，每組3個復(fù)孔，于培養(yǎng)的第1～7天每日采用MTT比色法檢測3個復(fù)孔的吸光度（A）值，以時間（d）為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制細胞的生長曲線。

1.2.2 細胞生長周期檢測方法 ①取對數(shù)生長MCF-7細胞，常規(guī)消化、計數(shù)，以細胞數(shù)為2×104個/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加RPMI 1640全培養(yǎng)基2 mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后在各培養(yǎng)孔中加入藥物。②將細胞分為4組，分別為對照組、索拉非尼單藥組、表阿霉素單藥組、聯(lián)合組。單藥組的給藥濃度分別為索拉非尼（2 μmol/L）、表阿霉素（0.5 μmol/L），聯(lián)合組中化療藥物的濃度與單藥組相同，對照組不加任何藥物。加藥后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，然后用不含EDTA的0.25%胰酶消化、收集各組細胞；③分別制備各組單細胞懸液，4℃ 1000 r/min離心5 min，形成細胞團。小心移去上清液，冰預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞2次，細胞濃度調(diào)整為2×105～5×105/mL。④用75%乙醇-20℃固定收集的細胞，過夜，用PBS液洗滌2次，2000 r/min離心5 min后，加入含有0.1%RnaseA的PBS液100 μL，10 μg/mL聚酰亞胺（PI）500 μL室溫避光染色30 min后上流式細胞儀進行細胞周期測定。本實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間A值比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞的生長狀況評價

從細胞的生長曲線可以看出，MCF-7細胞生長的初期（4 d）內(nèi)生長速度較快，4～5 d進入平臺期，后生長逐漸衰老。見圖1。

圖1 MCF-7細胞生長曲線

2.2 細胞周期檢測結(jié)果

索拉非尼單藥組、表阿霉素單藥組、聯(lián)合組G0/G1期細胞比率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），結(jié)果提示兩藥分別作用均可使細胞周期阻滯于G0/G1期；索拉非尼單藥組、表阿霉素單藥組S期細胞比率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），提示表阿霉素使細胞阻滯于S期；表阿霉素單藥組、索拉非尼單藥組G0/G1期細胞比率與聯(lián)合組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；聯(lián)合組S期細胞比率高于索拉非尼單藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；聯(lián)合組S期細胞比率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示，聯(lián)合組對細胞周期S期無明顯阻滯作用。見表1、圖2。

3 討論

乳腺癌是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致女性高病死率的主要因素，全球每年大約有100萬女性診斷為乳腺癌[9]。當(dāng)前主要靠化療來控制乳腺癌的進展，然而，只有少數(shù)患者能夠根治[10]。因此，迫切需要新的化療方案來改善乳腺癌患者的生存質(zhì)量。

細胞周期調(diào)控是一個精細的生物學(xué)過程，涉及了多個基因和蛋白的參與，進而形成了復(fù)雜的信號分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。因此，了解細胞周期及其相關(guān)基因的表達可以從基礎(chǔ)生物學(xué)研究的角度深入發(fā)掘腫瘤的本質(zhì)，闡明癌癥的發(fā)生機制，并為腫瘤的早期診斷提供標(biāo)志分子。此外，細胞周期蛋白的深入研究還能夠為設(shè)計特異性抑制腫瘤細胞生長的藥物和發(fā)展個體化的臨床治療方案提供理論基礎(chǔ)，為選擇特異性藥物靶點、優(yōu)化治療措施提供科學(xué)基礎(chǔ)[5]。近些年來出現(xiàn)的一些細胞周期阻滯藥，如異黃酮類能夠在低劑量時使細胞阻滯于G2/M期，高劑量時使細胞阻滯于S期，進而抑制多種腫瘤細胞生長。萜類化合物棉子酚能夠使腫瘤細胞的細胞周期阻滯于S期，而多萜類及半萜類化合物能夠抑制多種腫瘤細胞的G1期。苦參堿能夠使肝癌細胞系和慢性粒細胞白血病細胞系阻滯于S期，同時抑制端粒酶活性，進而抑制細胞生長。此外，從檳榔樹果中提取的檳榔堿能夠使口腔上皮癌細胞系阻滯于G2/M期，起到細胞毒作用[5]。

有報道稱，周期蛋白依賴性激酶（CDK）與相應(yīng)的細胞周期蛋白結(jié)合是啟動和進行細胞周期各類分子事件的必要條件，其通過對細胞周期蛋白的磷酸化修飾使細胞周期跨時相改變。不同種類的細胞周期蛋白可以結(jié)合不同種類的周期素依賴性蛋白激酶（CDKS），從而參加調(diào)控細胞周期的不同時相[11]。當(dāng)CDK2酶活性受到抑制后，促使CDK2活性降低或喪失，從而影響細胞周期的表型導(dǎo)致細胞G1期阻滯，抑制細胞DNA合成及增殖[12-13]。高雙全等[14]發(fā)現(xiàn)，CDK2-AP1基因能夠調(diào)控細胞周期，降低了細胞復(fù)制能力，這一結(jié)果證明了此基因表達對抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖具有良好的作用。這結(jié)果也說明了針對CDK2-AP1基因的靶向策略能夠抑制乳腺癌細胞的惡性增殖，為乳腺癌患者的后期治療提供理論基礎(chǔ)，CDK2-AP1基因能夠調(diào)控細胞周期，降低了細胞復(fù)制能力，這一結(jié)果證明了此基因表達對抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖具有良好的作用，也說明了針對CDK2-AP1基因的靶向策略能夠抑制乳腺癌細胞的惡性增殖，為乳腺癌患者的后期治療提供了理論基礎(chǔ)。索拉非尼作為多種酪氨酸激酶受體抑制劑能夠抑制各種生長信號及激酶受體本身對下游促細胞周期分子特別是對CDKS的激活效應(yīng)，進而間接地起到細胞周期阻滯作用。

Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼通過抑制人肝癌細胞株HepG2的RAF/ERK通路，使MEK和ERK的磷酸化水平下降，下調(diào)Cyclin D1，使增殖期細胞不能通過“G1～S”調(diào)節(jié)點，影響細胞增殖促進凋亡。Wei等[16]研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼聯(lián)合維生素K能在體外通過抑制p-ERK和Bcl-2的表達，增加p-JNK，c-Jun和FALS的表達，促進胰腺癌細胞的凋亡。一項索拉非尼用于治療轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的臨床Ⅱ期多中心不受控試驗中，56例患者中，至少54例患者使用單劑量的索拉非尼進行治療。1例患者局部緩解（2%），20例患者病情穩(wěn)定（37%），沒有觀察到完全緩解。有12例患者病情穩(wěn)定長于或等于16周（22%），7例患者病情穩(wěn)定長于或等于6個月（13%）。不推薦進一步研究索拉非尼單劑量的使用，但是聯(lián)合其他化療試劑使用值得深入研究[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼單藥能夠抑制乳腺癌癌細胞株的生長，且先用表阿霉素，后用索拉非尼的序貫給藥方式，有明顯的協(xié)同效應(yīng)。索拉非尼能夠誘導(dǎo)細胞阻滯于G0/G1期。表阿霉素使乳腺癌MCF-7細胞阻滯在S期。此外，本研究中應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期的結(jié)果表明，索拉非尼和表阿霉素單藥均能使細胞阻滯于G0/G1期，尤其是聯(lián)合用藥組阻滯更明顯；聯(lián)合組S期細胞比率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示，聯(lián)合組對細胞周期S期無明顯阻滯作用。

本研究表明表阿霉素和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用的生物化療模式提高了抗腫瘤活性，為進一步探討乳腺癌的治療方法提供了參考，未來生物化療模式將逐漸體現(xiàn)出其治療優(yōu)勢。

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[15] Liu L，Cao Y，Chen C，et al. Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway，inhibits tumor angiogenesis，and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5 [J].Cancer Res，2006，66（24）：11851-11858.

[16] Wei G，Wang M，Carr BI. Sorafenib combined vitamin K induces apoptosis in human pancreatic cancer cell lines through RAF/MEK/ERK and c-Jun NH2-terminal kinase pathways [J]. J Cell Physiol，2010，224（1）：112-119.

[17] Bianchi G，Loibl S，Zamagni C，et al. Phase Ⅱ multicenter，uncontrolled trial of sorafenib in patients with metastatic breast cancer [J]. Anticancer Drugs，2009，20（7）：616-624.

（收稿日期：2014-04-25 本文編輯：任 念）

Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼通過抑制人肝癌細胞株HepG2的RAF/ERK通路，使MEK和ERK的磷酸化水平下降，下調(diào)Cyclin D1，使增殖期細胞不能通過“G1～S”調(diào)節(jié)點，影響細胞增殖促進凋亡。Wei等[16]研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼聯(lián)合維生素K能在體外通過抑制p-ERK和Bcl-2的表達，增加p-JNK，c-Jun和FALS的表達，促進胰腺癌細胞的凋亡。一項索拉非尼用于治療轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的臨床Ⅱ期多中心不受控試驗中，56例患者中，至少54例患者使用單劑量的索拉非尼進行治療。1例患者局部緩解（2%），20例患者病情穩(wěn)定（37%），沒有觀察到完全緩解。有12例患者病情穩(wěn)定長于或等于16周（22%），7例患者病情穩(wěn)定長于或等于6個月（13%）。不推薦進一步研究索拉非尼單劑量的使用，但是聯(lián)合其他化療試劑使用值得深入研究[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼單藥能夠抑制乳腺癌癌細胞株的生長，且先用表阿霉素，后用索拉非尼的序貫給藥方式，有明顯的協(xié)同效應(yīng)。索拉非尼能夠誘導(dǎo)細胞阻滯于G0/G1期。表阿霉素使乳腺癌MCF-7細胞阻滯在S期。此外，本研究中應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期的結(jié)果表明，索拉非尼和表阿霉素單藥均能使細胞阻滯于G0/G1期，尤其是聯(lián)合用藥組阻滯更明顯；聯(lián)合組S期細胞比率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示，聯(lián)合組對細胞周期S期無明顯阻滯作用。

本研究表明表阿霉素和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用的生物化療模式提高了抗腫瘤活性，為進一步探討乳腺癌的治療方法提供了參考，未來生物化療模式將逐漸體現(xiàn)出其治療優(yōu)勢。

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[17] Bianchi G，Loibl S，Zamagni C，et al. Phase Ⅱ multicenter，uncontrolled trial of sorafenib in patients with metastatic breast cancer [J]. Anticancer Drugs，2009，20（7）：616-624.

（收稿日期：2014-04-25 本文編輯：任 念）

Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼通過抑制人肝癌細胞株HepG2的RAF/ERK通路，使MEK和ERK的磷酸化水平下降，下調(diào)Cyclin D1，使增殖期細胞不能通過“G1～S”調(diào)節(jié)點，影響細胞增殖促進凋亡。Wei等[16]研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼聯(lián)合維生素K能在體外通過抑制p-ERK和Bcl-2的表達，增加p-JNK，c-Jun和FALS的表達，促進胰腺癌細胞的凋亡。一項索拉非尼用于治療轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的臨床Ⅱ期多中心不受控試驗中，56例患者中，至少54例患者使用單劑量的索拉非尼進行治療。1例患者局部緩解（2%），20例患者病情穩(wěn)定（37%），沒有觀察到完全緩解。有12例患者病情穩(wěn)定長于或等于16周（22%），7例患者病情穩(wěn)定長于或等于6個月（13%）。不推薦進一步研究索拉非尼單劑量的使用，但是聯(lián)合其他化療試劑使用值得深入研究[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼單藥能夠抑制乳腺癌癌細胞株的生長，且先用表阿霉素，后用索拉非尼的序貫給藥方式，有明顯的協(xié)同效應(yīng)。索拉非尼能夠誘導(dǎo)細胞阻滯于G0/G1期。表阿霉素使乳腺癌MCF-7細胞阻滯在S期。此外，本研究中應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期的結(jié)果表明，索拉非尼和表阿霉素單藥均能使細胞阻滯于G0/G1期，尤其是聯(lián)合用藥組阻滯更明顯；聯(lián)合組S期細胞比率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示，聯(lián)合組對細胞周期S期無明顯阻滯作用。

本研究表明表阿霉素和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用的生物化療模式提高了抗腫瘤活性，為進一步探討乳腺癌的治療方法提供了參考，未來生物化療模式將逐漸體現(xiàn)出其治療優(yōu)勢。

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（收稿日期：2014-04-25 本文編輯：任 念）