朱楠，劉俊，張馨宇，董娟娥

西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100

植物原生質體是被脫掉了細胞壁、僅有質膜包圍、裸露而生活的植物細胞。質膜在生命活動中的作用極為重要，例如信息傳遞、能量轉換、物質運輸?shù)壬F(xiàn)象都與質膜有密切的關系[1]。原生質體裸露而具生活力的特性為與植物質膜功能有關的研究提供了有利的條件，已在細胞水平上揭示了一系列生命過程的本質[2]。植物對誘導子的抵抗反應是在細胞水平上進行的，在整體水平上進行研究受到了各種干擾，而用原生質體作為材料則可排除干擾，對于闡明植物抗逆性的生化過程及在細胞水平上所發(fā)生的現(xiàn)象非常有利[1]。如多種外界刺激，包括誘導子、機械刺激、低溫脅迫、滲透脅迫、光和氧化脅迫[3-8]等均能引起植物細胞胞質游離Ca2+濃度升高。Ca2+的信使功能通過調控細胞內游離Ca2+濃度來實現(xiàn)[9-10]。胞質Ca2+濃度常用激光共聚焦顯微鏡檢測[11]，但由于細胞壁的酯酶對Fluo-3/AM熒光探針的水解而使裝載失敗，影響檢測[12-13]，利用原生質體可使探針順利進入細胞內準確檢測胞質游離Ca2+。

常用來提取原生質體的材料有植物的幼葉、子葉、根和下胚軸[2,14-17]等。植物的愈傷組織內有大量的細胞間隙，是一團薄壁的松散的細胞團，其細胞壁易被酶解，是制備原生質體的理想材料。本研究從丹參懸浮培養(yǎng)細胞原生質體分離過程中的酶液配比、酶解時間、甘露醇濃度、離心條件等方面進行考察，分析各因素對其原生質體產(chǎn)量及活力的影響，建立丹參懸浮培養(yǎng)細胞原生質體的制備方法。并以Fluo-3/AM為熒光探針，以水楊酸為誘導子，利用激光共聚焦顯微觀測水楊酸 (Salicylic acid)誘導后丹參胞質 Ca2+信號的時空變化。為利用原生質體進行細胞信號轉導研究奠定基礎。

1 儀器、試劑與方法

1.1 儀器

普通光學顯微鏡，倒置熒光顯微鏡 (Leica DMI3000B型，德國)；激光共聚焦顯微鏡(AIR/A1型，日本尼康)；臺式冷凍離心機(Allegra X-15R型，美國貝克曼庫爾特)；電熱恒溫水浴鍋 (森信 DK-S26型)；無菌過濾器(Millex-HV 0.45 μm)。

1.2 試劑

水楊酸 (Salicylic acid, Sigma, 批號69-72-7)，纖維素酶 (R-10, Yakult Honsha,216017)，果膠酶 (Y-23, Yakult Honsha, Y-007)，離析酶 (R-10, Yakult Honsha, 202047)，二乙酸熒光素 (FDA, aladdin, 596-09-8)，鈣離子熒光探針 (Fluo-3/AM, Sigma, 121714-22-5)，二甲基亞砜 (DMSO, Sigma, 67-68-5)，聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽 (Poly-L-lysine hydrobromide, Wt 300 000,Sigma, 25988-63-0)，甘露醇 (Amresco, 69-65-8,USP級)，牛血清白蛋白 (BSA, Sigma,9048-46-8)，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 (MES,Genview, 4432-31-9)，NAA (天津博迪化工有限公司)，6-BA (北京康倍斯科技有限公司)，2,4-D(北京康倍斯科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 誘導愈傷組織及繼代培養(yǎng)

將丹參種子 (來源于陜西商洛丹參 GAP藥源基地)培育出無菌苗，再將丹參無菌苗上生長健壯的葉片剪成 0.5 cm×0.5 cm大小的外植體。在無菌條件下，將外植體接種于MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中含有 1.0 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2,4-D、5.5 g/L 瓊脂、30 g/L蔗糖，在光照條件下誘導形成愈傷組織。將誘導出的愈傷組織每20 d繼代培養(yǎng)1次。培養(yǎng)條件同上。

將繼代培養(yǎng) 3代性狀穩(wěn)定的愈傷組織再培養(yǎng)12 d，轉接到含25 mL MS液體培養(yǎng)基 (無生長調節(jié)物質和瓊脂)的50 mL的三角瓶中，在轉速為125 r/min、溫度為25 ℃的條件下黑暗懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng) 6 d的細胞用于原生質體的分離。

1.3.2 原生質體的分離

分別用不同濃度的纖維素酶、果膠酶、離析酶及其組合處理材料。酶的溶劑為0.4 mol/L甘露醇、20 mmol/L的KCl、20 mmol/L的MES的混合溶液，用1 mol/L KOH調至pH 5.7。10 mL酶溶劑中加入組合酶后在 55 ℃水浴鍋中活化10 min，放置到常溫后再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾滅菌。加入1.5 g鮮重的懸浮細胞，酶解混合物置于40 r/min、25 ℃黑暗條件下酶解4?20 h，每隔 2 h取樣在顯微鏡下觀察原生質體的形態(tài)和活力，確定酶濃度及酶解時間。結果為 3組平行實驗的平均值。

1.3.3 原生質體純化

利用上述選擇的酶濃度組合充分酶解材料后，酶解混合物經(jīng) 80 r/min離心 1 min，再用600目尼龍網(wǎng)過濾酶解混合液至 50 mL離心管中，加入等體積W5溶液 (154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES-K，pH值5.7)，在不同離心速度 (300 r/min、600 r/min、1 000 r/min)下離心5 min，棄上清；再加入10 mL W5溶液離心5 min，棄上清，再加入2 mL W5溶液重懸后于冰上放置30 min后離心3 min，棄上清。加入1.5 mL W5溶液 (含0.4 mol/L甘露醇)重懸保存，得到純化的原生質體。

1.3.4 原生質體的計數(shù)

用W5 稀釋原生質體溶液5倍，取少量上述原生質體懸浮液滴加在 0.1 mm 血球計數(shù)板上。當原生質體充滿計數(shù)室后，在光學顯微鏡下觀察，并用細胞計數(shù)板測定原生質體的濃度：計算 4 個角上大格及中央大格 (共 5個大格)內的原生質體個數(shù)，然后按公式計算原生質體數(shù)，每個樣品計數(shù) 3個重復，最后計算出每克鮮重材料游離得到的原生質體產(chǎn)量 (個/g FW)。

1.3.5 原生質體的活力檢測

原生質體活力測定用 0.01%二乙酸熒光素(FDA)染色，用熒光顯微鏡統(tǒng)計發(fā)綠色熒光的原生質體數(shù)和原生質體總數(shù)，選取 3個有代表性的視野進行統(tǒng)計，取平均值。原生質體活力以一個視野中有活力的原生質體數(shù)占該視野中原生質體總數(shù)的百分數(shù)來表示。

1.3.6 Ca2+熒光探針Fluo-3/AM的裝載

利用激光共聚焦顯微鏡進行觀測前，原生質體需要進行貼壁固定。用30萬分子量的多聚賴氨酸包被的蓋玻片來固定原生質體，多聚賴氨酸的工作濃度為0.02 g/mL。Fluo-3/AM (溶于無水DMSO中，配成1 mmol/L的母液，于–20 ℃貯存，用W5溶液 (含0.4 mol/L甘露醇)稀釋母液至終濃度為20 μmol/L則為Fluo-3/AM工作液。

將丹參懸浮細胞原生質體孵育在Fluo-3/AM工作液中1 h。W5洗滌兩遍后，室溫下靜置1 h。之后固定在多聚賴氨酸處理的玻片上，再施加 22 mg/L的水楊酸處理。在處理30 min內，每30 s測定1次熒光并拍照。激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為510 nm。

2 結果與分析

2.1 酶對原生質體產(chǎn)量和活力的影響

以丹參懸浮培養(yǎng)細胞為材料，用不同的酶液組合 (0.4 mol/L甘露醇調節(jié)滲透壓)處理12 h，600 r/min離心收集原生質體，結果如圖1所示。纖維素酶 1.5%+果膠酶 0.3%組合提取得到的原生質體產(chǎn)量較低 (1.4×105個)；纖維素酶1.5%、果膠酶0.3%和離析酶0.5%聯(lián)合使用可使原生質體的產(chǎn)量增加至1.1×106個，這可能是由于離析酶的添加增加了酶解細胞壁的能力；但將 3種酶濃度均增大后并沒有增加原生質體產(chǎn)量 (圖1A)。取酶液處理后的材料鏡檢發(fā)現(xiàn)，酶液組合 (纖維素酶 3.0%+果膠酶 0.6%+離析酶1.0%)處理后破碎的細胞增多，部分原生質體發(fā)生破碎導致產(chǎn)量降低。用纖維素酶1.5%+果膠酶 0.3%+離析酶 0.5%處理得到的原生質體，F(xiàn)DA孵育后在熒光顯微鏡下發(fā)熒光的數(shù)目最多(圖1B)，且活力最高 (圖1C)，其他處理得到的原生質體發(fā)熒光數(shù)目和活力較低 (圖1B、1C)。

2.2 酶解時間對原生質體產(chǎn)量和活力的影響

用酶液組合 (纖維素酶1.5%+果膠酶0.3%+離析酶 0.5%)酶解不同時間觀察原生質體的產(chǎn)量和活力，結果如圖2所示。酶解6 h時原生質體產(chǎn)量很低，6 h以后產(chǎn)量明顯提高，12 h時原生質體產(chǎn)量最高，14 h后大幅度下降 (圖2A)。鏡檢發(fā)現(xiàn)，酶解14 h后酶解液中碎片明顯增多，說明原生質體產(chǎn)量下降是由于原生質體破碎導致的結果。FDA孵育后發(fā)熒光原生質體數(shù)目和產(chǎn)量的變化規(guī)律是一致的，酶解12 h得到的原生質體發(fā)熒光數(shù)目最多 (圖2B)。酶解10 h以內的原生質體活力低于90%，酶解10?16 h的原生質體活力均處于高水平 (＞95%)，超出16 h后活力急劇下降 (圖2C)。

圖1 酶對原生質體產(chǎn)量和活力的影響 (A：酶液組合對原生質體產(chǎn)量的影響；B：酶液組合對發(fā)熒光原生質體數(shù)的影響；C：酶液組合對原生質體活力的影響)Fig. 1 The influence of enzymes on protoplast yield and vitality. (A)The influence of enzyme liquid combination on protoplast yield. (B)Combination of enzyme liquid on fluoresce protoplast number. (C)The influence of liquid combination on protoplast enzyme activity. Abscissa chart represents different enzyme liquid combination. C, P and M given in abscissa of the chart means cellulase, pectinase and macerozyme respectively.

圖2 酶解時間對原生質體產(chǎn)量和活力的影響 (A：酶解時間對產(chǎn)量的影響；B：酶解時間對發(fā)熒光原生質體數(shù)的影響；C：酶解時間對原生質體活力的影響)Fig. 2 The influence of enzymatic hydrolysis time on protoplast yield and vitality. (A)The influence of enzymatic hydrolysis time on protoplast yield. (B)Enzymatic hydrolysis time on fluoresce protoplast number. (C)The influence of enzymatic hydrolysis time on protoplast enzyme activity.

2.3 酶液中甘露醇濃度對原生質體產(chǎn)量和活力的影響

當酶解液的滲透壓與原生質體不能維持等滲時，原生質體會脹裂或者皺縮，適宜的滲透壓是獲得高質量原生質體的必要條件。甘露醇在酶解液中的主要作用是維持滲透壓，甘露醇的濃度很大程度上決定了原生質體的產(chǎn)量和活力。以上述選擇的酶組合酶解12 h，考察酶液中不同甘露醇濃度對原生質體產(chǎn)量和活力的影響，結果如圖3所示。0.3 mol/L的甘露醇濃度下，原生質體產(chǎn)量雖然高但活力較低，鏡檢發(fā)現(xiàn)破碎細胞很多，這可能是由于低濃度甘露醇使原生質體在離心收集時易于沉降，但滲透壓太低無法使細胞內外等滲造成原生質體脹破，收集的原生質體量多但破碎的也很多；在0.4?0.5 mol/L的甘露醇濃度下，原生質體的產(chǎn)量較高 (產(chǎn)量高于 106個)；甘露醇濃度高于0.5 mol/L時原生質體產(chǎn)量急劇下降，主要是由于滲透壓太高使得原生質體離心收集時難以沉降造成低產(chǎn)量 (圖 3A)。低滲透壓 (0.3 mol/L甘露醇)和高滲透壓 (0.6?0.7 mol/L甘露醇)下，F(xiàn)DA孵育后發(fā)熒光原生質體數(shù)目較少 (圖3B)，原生質體活力較低 (<80%)(圖3C)，主要是由于低滲透壓會造成原生質體破裂，高滲透壓則造成原生質體皺縮。滲透壓適宜時(0.4?0.5 mol/L甘露醇)提取得到的原生質體FDA孵育后發(fā)熒光的數(shù)目最多 (圖 3B)，活力最高 (96%)(圖 3C)。

2.4 離心速度對原生質體產(chǎn)量和活力的影響

在上述選擇的最佳組合條件下處理培養(yǎng)細胞，考察不同離心速度對原生質體活力和產(chǎn)量的影響，結果如圖4所示。600 r/min離心得到的原生質體產(chǎn)量最高，轉速過低 (300 r/min)和過高 (1 000 r/min)收集到的原生質體產(chǎn)量都較低，主要是由于低轉速時原生質體難以沉降，高轉速則使其易于破碎 (圖4A)。適宜轉速 (600 r/min)離心收集得到的原生質體，F(xiàn)DA染色后發(fā)熒光數(shù)目最多 (圖4B)，原生質體活力最高 (圖4C)，主要是因為細胞碎片在此轉速下不易沉降，而完整的原生質體又能被沉降收集。

圖3 甘露醇濃度對原生質體產(chǎn)量和活力的影響 (A：甘露醇濃度對原生質體產(chǎn)量的影響；B：甘露醇濃度對發(fā)熒光原生質體數(shù)的影響；C：甘露醇對原生質體活力的影響)Fig. 3 The influence of mannitol concentrations on protoplast yield and vitality. (A)The influence of mannitol concentrations on protoplast yield. (B)Mannitol concentration on fluoresce protoplast number. (C)The influence of mannitol concentrations on protoplast enzyme activity.

圖4 離心速度對原生質體產(chǎn)量和活力的影響 (A: 離心速度對原生質體產(chǎn)量的影響；B: 離心速度對發(fā)熒光原生質體數(shù)的影響；C：離心速度對原生質體活力的影響)Fig. 4 The influence of centrifugal speeds on protoplast yield and vitality. (A)The influence of centrifugal speeds on protoplast yield. (B)Centrifugal speeds on fluoresce protoplast number. (C)The influence of centrifugal speeds on protoplast enzyme activity.

2.5 原生質體活力檢測

FDA是一種親脂性物質，可以透過原生質膜進入細胞內部，被胞內脂酶分解成一種發(fā)熒光的非親脂性物質，用于檢測細胞膜的完整性，熒光越強表示原生質體活力越高，破碎或無生命活力的原生質體則不發(fā)熒光。圖5A?5E分別為可見光下純化后的原生質體、488 nm激發(fā)光下經(jīng)FDA染色后的發(fā)綠色熒光的原生質體、熒光顯微鏡下FDA染色后原生質體、激光共聚焦顯微下FDA染色后原生質體3D全熒光效果圖和明場下的原生質體激光顯微圖片。可以看出，F(xiàn)DA可定位于細胞膜，指示細胞膜的完整性，說明在本實驗條件下提取的原生質體活力較高。

圖5 原生質體活力檢測 (A：可見光下的原生質體；B：488 nm激發(fā)光下經(jīng)FDA染色后的原生質體；C：熒光顯微鏡下FDA染色；D：激光共聚焦顯微下FDA染色后原生質體3D全熒光效果圖；E：激光共聚焦顯微鏡明場下的原生質體)Fig. 5 Protoplast dynamic detection. (A)Protoplasts in bright field. (B)Protoplasts after FDA staining in excitation 488 nm. (C)Protoplasts after FDA staining under fluorescence microscope in excitation 488 nm. (D)Protoplasts after FDA staining under the laser confocal microscope in excitation 488 nm. (E)Protoplasts under the laser confocal microscope in bright field.

2.6 水楊酸刺激引起丹參培養(yǎng)細胞原生質體胞質Ca2+迸發(fā)

為了進一步觀察提取的丹參培養(yǎng)細胞原生質體的結構和活力是否可以滿足研究的要求，利用22 mg/L的水楊酸瞬時刺激原生質體，觀察胞質Ca2+的熒光變化，如圖6、7所示。水楊酸可以顯著誘導丹參培養(yǎng)細胞原生質體的胞質Ca2+迸發(fā)，水楊酸處理后0.7 min胞質Ca2+熒光強度開始快速升高，至12 min時熒光強度達到最大，是對照 (水處理)的4.3倍，說明水楊酸瞬時刺激誘發(fā)了胞質 Ca2+迸發(fā)。圖 7為與之對應的原生質體熒光變化激光共聚焦顯微圖片。分別用胞外、胞內 Ca2+抑制劑 2-APB和 LaCl3處理后，均抑制了水楊酸誘導的胞質Ca2+迸發(fā)，使熒光強度顯著低于水楊酸處理，主要是由于鈣通道抑制劑阻斷了胞內、胞外鈣庫中的鈣離子流向胞質。說明本實驗條件提取的原生質體完全能夠滿足研究要求。

圖6 水楊酸對丹參懸浮培養(yǎng)細胞原生質體胞質Ca2+熒光強度的影響 (A：水楊酸處理后Ca2+熒光強度；B：抑制劑處理后Ca2+熒光強度)Fig. 6 The influence of salicylic acid on [Ca2+]cyt fluorescence intensity of protoplasts which from salvia miltiorrhiza suspension culture cells. (A)[Ca2+]cyt fluorescence intensity curve after salicylic acid added. (B)[Ca2+]cyt fluorescence intensity curve after inhibitors added.

圖7 水楊酸處理引起丹參培養(yǎng)細胞原生質體胞質鈣離子迸發(fā) (A：水處理；B：水楊酸處理；C：水楊酸+2-APB處理；D：水楊酸+LaCl3處理；a?d分別為A?D對應的明場下原生質體激光共聚焦顯微圖片)Fig. 7 Salicylic acid induced [Ca2+]cyt burst of protoplasts of Salvia miltiorrhiza suspension culture cells. (A)H2O treatment. (B)Salicylic acid treatment. (C)Salicylic acid+2-APB treatment. (D)Salicylic acid+ LaCl3 treatment;(A?D): Fluo-3/AM, excitation 488 nm. (a?d)Bright field.

3 討論與結論

原生質體的提取、分離、純化對環(huán)境的要求十分嚴格，用于除去細胞壁的酶的濃度和配比組合直接影響原生質體的產(chǎn)量[18]。植物細胞除去細胞壁后，如果酶液中的滲透壓和細胞內的滲透壓不平衡，會導致原生質體漲破或收縮[15]。因此，在配制酶解液、洗液和培養(yǎng)液中，加入一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑，使胞外滲透壓大致與原生質體內的滲透壓相同或相近[17]。在對提取好的原生質體進行收集時，離心機的轉速直接影響原生質體的產(chǎn)量[15]，適宜的轉速不僅能保持原生質體不被外力破碎，且能在最大程度上獲得更高產(chǎn)量的完整的原生質體。FDA是一種親脂性物質，可以透過質膜，被質膜中的酯酶分解成一種非親脂性的物質，用于反應細胞膜的完整性，熒光越強則原生質體活力越高。本研究采用甘露醇作為滲透壓穩(wěn)壓劑，在溶液中加入了 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸有助于提高原生質體細胞膜的穩(wěn)定性。

細胞通過細胞表面受體感受外界刺激后,將胞外信號轉化為胞內信號，并通過細胞內信使系統(tǒng)級聯(lián)放大信號，調節(jié)相應酶或基因的活性[19]。鈣信號轉導在調節(jié)植物生長、發(fā)育、代謝及適應環(huán)境中都有重要作用[6,20]。將鈣離子探針 Fluo-3/AM成功導入細胞中是檢測胞質鈣離子的關鍵步驟，對于帶有細胞壁的植物細胞常常因為細胞壁中存在的非特異性酯酶的影響而使裝載失敗[12-13]。利用除去細胞壁得到的原生質體則可以解決探針無法進入胞質的問題[21]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸作為誘導子可以有效提高丹參培養(yǎng)細胞中丹酚酸 B[22]和迷迭香酸[23]的生物合成，其生物合成很可能與 Ca2+信號有關[24-26]。但 Ca2+在水楊酸誘導次生代謝物合成過程中的作用機制并不清楚。

本研究成功制備了丹參懸浮培養(yǎng)細胞的原生質體。制備條件為：纖維素酶1.5%、果膠酶0.3%、離析酶0.5%、0.4 mol/L甘露醇，酶解時間為12 h，在600 r/min下離心5 min收集，得到的原生質體產(chǎn)量為1.1×106，活力達到95%以上。在該條件下提取的原生質體完全能夠滿足后續(xù)以單個細胞為研究對象的一系列研究，為后續(xù)利用顯微方法和成像技術研究誘導子誘導的鈣信號的產(chǎn)生、傳導及其對植物次生代謝的影響奠定了基礎。

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