基于氫氘交換核磁共振技術(shù)研究蛋白質(zhì)與陽離子交換介質(zhì)的相互作用

王康，郝冬霞，齊樹亭，馬光輝

1 河北工業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300130

2 中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

隨基因工程等現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，以細(xì)胞為工廠生產(chǎn)疫苗、抗體、酶、細(xì)胞因子等蛋白產(chǎn)品已成為趨勢。細(xì)胞產(chǎn)物的復(fù)雜性使高效柱層析成為蛋白產(chǎn)品分離純化的支撐技術(shù)，其中，離子交換層析又是蛋白質(zhì)分離純化中最常用的手段之一[1-2]。然而，由于蛋白分子易失活，常造成層析中洗脫峰的展寬、拖尾及肩峰，最終造成蛋白回收率、選擇性和柱效顯著下降等諸多問題，因此，蛋白活性保持困難仍然是目前離子交換層析中普遍面臨的瓶頸問題。

蛋白質(zhì)的活性保持和選擇性機(jī)制取決于蛋白與層析介質(zhì)的相互作用過程。因此，探索蛋白在層析介質(zhì)上的結(jié)構(gòu)變化是一直以來的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)研究多從蛋白的宏觀保留行為 (保留時(shí)間、收率、活性)上來推測不同介質(zhì)及操作條件對蛋白與介質(zhì)微觀吸附過程的影響[1,3-4]。近年來，隨著新型微觀界面分析儀器的出現(xiàn)及組合聯(lián)用，該領(lǐng)域有望上升至分子層次上研究蛋白質(zhì)在層析介質(zhì)表面的結(jié)構(gòu)變化[5-8]。在目前已建立的蛋白質(zhì)在液固界面的微觀表征手段中，如熒光光譜 (FR)、圓二色譜 (CD)、原子力 (AFM)、雙偏振極化干涉儀 (DPI)、質(zhì)譜 (MS)等[9-13]，已可獲取大量蛋白分子水平信息包括蛋白質(zhì)吸附厚度、形貌特征、聚集狀態(tài)、吸附取向等。但是由于這些技術(shù)大多局限于芯片平面材料或納米球材料上檢測，原位實(shí)時(shí)捕捉多孔介質(zhì)內(nèi)的蛋白分子結(jié)構(gòu)變化信息至今仍很難實(shí)現(xiàn)。

據(jù)此，本課題組設(shè)計(jì)了一條蛋白質(zhì)氫氘交換反應(yīng)與核磁共振技術(shù)相結(jié)合的新型蛋白質(zhì)液固界面表征路線，并在前期成功地表征了不同配基密度的疏水介質(zhì)誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)去折疊行為[14]。本研究利用這種新型蛋白質(zhì)液固界面表征手段。以離子交換色譜過程為研究對象，陽離子交換介質(zhì) (SP Sepharose FF)為模型介質(zhì)，溶菌酶為模型蛋白。探索酰胺的氫氘交換對于表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的可行性，并獲取溶菌酶在介質(zhì)表面吸附時(shí)的去折疊行為以及綁定位點(diǎn)變化。以期為進(jìn)一步理解蛋白質(zhì)與離子交換介質(zhì)微觀作用機(jī)制，以及蛋白質(zhì)分離純化條件及層析介質(zhì)結(jié)構(gòu)的精確設(shè)計(jì)和定向優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋清溶菌酶 (Hen egg white Lysozyme)購自 Sigma公司；陽離子交換凝膠介質(zhì) (SP Sepharose FF)購自GE Healthcare公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 核磁共振波譜儀及參數(shù)

600 M核磁共振波譜儀 (Bruker Ascend-600 Avance Ⅲ)，TCI三共振反式超低溫探頭。一維核磁共振氫譜 (1H-NMR)采用的脈沖程序?yàn)閚oesygppr1d，采樣 16次；二維氫氫全相關(guān)譜(2D-1H-1H TOCSY)采用的脈沖程序?yàn)閐ipsi2gpph19，采樣24次；采樣前進(jìn)行90°脈沖校準(zhǔn)以及水峰的壓制。

1.3 吸附蛋白的氫氘交換標(biāo)記

蛋白在陽離子交換介質(zhì)上的吸附以及標(biāo)記路線如圖 1所示。首先，陽離子交換介質(zhì) SP Sepharose FF裝填成柱體積為1 mL的色譜柱，用起始緩沖液 (20 mmol/L PBS, pH 7.0)平衡色譜柱；然后，蛋白質(zhì)溶解到起始緩沖液配成0.21 mmol/L溶液，進(jìn)樣5 mL，緩沖液淋洗并且檢測紫外吸收值，當(dāng)紫外吸收值為0時(shí)，停止淋洗。其次，用標(biāo)記緩沖液 (D2O，20 mmol/L PBS，pD 7.0)流經(jīng)色譜柱，15 min后通入淬滅緩沖液(D2O，20 mmol/L NaAC，pD 3.0)終止氫氘交換反應(yīng)。最后，已經(jīng)標(biāo)記完的蛋白用洗脫液 (D2O，20 mmol/L NaAC，1 mol/L NaCl，pD 3.0)洗脫，所獲的標(biāo)記蛋白用 3 kDa的超濾膜脫鹽凍干之后核磁共振檢測。對照組樣品 (沒有吸附的蛋白)的做法和上述步驟相似，除去不添加吸附陽離子交換介質(zhì)以及洗脫液。

1.4 氫氘交換數(shù)據(jù)分析

圖1 蛋白質(zhì)在陽離子交換介質(zhì)上吸附、標(biāo)記及檢測路線Fig. 1 The adsorption, labeling and NMR analysis of protein on cation exchange media (SP Sepharose FF).

溶菌酶氨基酸殘基核磁共振信號根據(jù)與 α位碳相連的酰胺氫 (NH-CαH)來歸屬，并以文獻(xiàn)報(bào)道[15]結(jié)合生物大分子核磁共振數(shù)據(jù)庫Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB 4562)為參考。峰強(qiáng)度 (I)通過軟件 Topspin version 3.0標(biāo)定。為了排除樣品濃度的影響，以不發(fā)生氫氘交換的芳香族氨基酸Trp108的 H4-H5相關(guān)峰為參考峰，對特征殘基峰的強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，如式 (1)：

式中Ipeak為殘基峰的強(qiáng)度；Ireference為參考峰的強(qiáng)度；Inomalize為歸一化后的峰強(qiáng)度。通過比較不同狀態(tài)歸一化后蛋白殘基峰強(qiáng)度的變化可以獲取蛋白各個(gè)殘基酰胺氫對溶劑可及的敏感程度以及酰胺氫被保護(hù)程度等信息[16-17]。

1.5 溶劑可及表面計(jì)算

通過分子模擬軟件Accelrys discovery studio(Accelrys, Inc. San Diego, USA)計(jì)算蛋白各個(gè)殘基的溶劑可及表面百分比 (Solvent accessible surface area，SASA)。溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 (PDB code: 1E8L)，探針半徑為 1.4 ?。

1.6 蛋白靜電勢計(jì)算

蛋白質(zhì)靜電勢采用通用算法程序，利用分子模擬Accelrys discovery studio軟件中Delphi模塊進(jìn)行蛋白靜電勢的模擬計(jì)算[18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶的氫氘交換特征

蛋白質(zhì)氫氘交換技術(shù)是探測溶液中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、折疊動(dòng)力學(xué)和相互作用的重要研究工具，但在蛋白質(zhì)液固界面吸附中應(yīng)用較少。為確定溶菌酶在液固界面研究中的交換條件和可行性，首先考察了溶菌酶的氫氘交換特征，通過測定溶菌酶在不同狀態(tài)下1D1H-NMR譜及其酰胺氫峰強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，來評估蛋白結(jié)構(gòu)對氫氘交換的敏感性以及交換反應(yīng)的合理時(shí)間。

結(jié)果如圖 2所示，測定了溶菌酶在天然態(tài)(90% H2O/10% D2O，pH 7.0，25 ℃)和變性態(tài)(60% ACN/40% D2O，pH 7.0，25 ℃)不同時(shí)間間隔點(diǎn)的一維核磁共振氫譜 (1D1H-NMR)。其中，由于1D氫譜中大部分殘基的譜峰疊加，單獨(dú)選取了譜峰清晰分辨率較高的W123、W111、W63和 W108四個(gè)代表殘基來觀察溶菌酶在天然態(tài)和變性態(tài)的動(dòng)力學(xué)變化。天然態(tài) (圖2，A-1、A-2)顯示，4個(gè)殘基的酰胺氫峰強(qiáng)度在開始10 min內(nèi)快速下降，在20 min到180 min時(shí)則下降趨緩。對比變性態(tài) (圖 2 B-1、B-2)，溶菌酶酰胺氫不但化學(xué)位移有顯著變化，并且4個(gè)殘基的峰強(qiáng)在更短時(shí)間約5 min內(nèi)降到最低。這反映出天然態(tài)溶菌酶能夠保持緊密三維球形狀態(tài)，氘離子較難到達(dá)處于蛋白內(nèi)部的殘基區(qū)域，氫氘交換速率及峰強(qiáng)下降比較緩慢；而在變性劑乙腈溶液中，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使個(gè)別殘基峰周圍的電子云環(huán)境改變而造成化學(xué)位移改變，并且由于蛋白去折疊，溶劑中的氘離子很容易到達(dá)去折疊的酰胺區(qū)域發(fā)生氘代反應(yīng)，峰強(qiáng)下降且很快達(dá)到平衡。以上現(xiàn)象表明溶菌酶的結(jié)構(gòu)變化對氫氘交換反應(yīng)非常敏感，蛋白的去折疊程度可由其評估。此外氫氘交換在天然態(tài)和變性態(tài)下達(dá)到平衡的時(shí)間分別是10 min和5 min，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白在陽離子交換介質(zhì)上吸附交換時(shí)間控制在10 min以上。

圖2 不同溶液中，溶菌酶一維核磁共振氫譜 (A)及殘基峰強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況 (B)Fig. 2 1D IH NMR spectra (amide/aromatic region)of lysozyme in different solvents and the intensity change of selected residues (marked)as a function of time.

2.2 溶菌酶在陽離子交換介質(zhì)表面的吸附行為

由于溶菌酶核磁信號在一維氫譜上嚴(yán)重重疊無法指認(rèn)各個(gè)殘基。因此本文擬通過二維氫譜中化學(xué)位移全相關(guān)譜TOCSY譜 (Total chemical shift correlation spectroscopy)來獲得殘基信息。TOCSY譜可以描述在蛋白肽鏈內(nèi)具有α-H、β-H間偶極偶合相關(guān)的氫信號，其優(yōu)點(diǎn)是以交叉峰的形式指認(rèn)各個(gè)殘基，譜峰很少重疊、分辨率較高。利用該技術(shù)，本文繼續(xù)考察了溶菌酶在陽離子交換介質(zhì)表面的吸附行為，根據(jù)各殘基峰強(qiáng)度可以獲知溶菌酶上氫質(zhì)子被氘取代的程度，從而判斷出蛋白質(zhì)的去折疊程度。

在以上溶液實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對比吸附態(tài)與天然態(tài)溶菌酶的TOCSY譜 (圖3)，顯示吸附態(tài)時(shí)溶菌酶殘基酰胺氫信號的丟失要多于天然態(tài)。說明吸附到陽離子交換介質(zhì)上的溶菌酶暴露出更多的殘基在重水溶劑里；同時(shí)，也說明溶菌酶緊密的球狀蛋白開始松解，由此可推測陽離子交換介質(zhì)表面的靜電基團(tuán)是介導(dǎo)溶菌酶去折疊行為的主要機(jī)制。

為詳細(xì)了解溶菌酶蛋白各區(qū)域在陽離子交換介質(zhì)表面的去折疊行為，對各個(gè)殘基酰胺氫的交聯(lián)峰進(jìn)行歸屬和回歸分析 (圖4)。吸附態(tài)和天然態(tài)殘基峰強(qiáng)度對比顯示，吸附態(tài)殘基峰強(qiáng)度明顯比天然態(tài)殘基弱，說明吸附態(tài)暴露出更多殘基在溶液中。但是，絕大部分的殘基信號保留下來，說明溶菌酶的結(jié)構(gòu)只是發(fā)生局部去折疊，例如一些二級結(jié)構(gòu) α-helix、β-sheet (H1、H2、H3、H4、H5、H6，S2、S1除外)能夠保持其原有結(jié)構(gòu)。此外，不同的結(jié)構(gòu)片段呈現(xiàn)出不同的氫信號保護(hù)程度，一些無規(guī)則卷曲 (Coil，bend，and turn)片段的氫信號就更容易失去 (如 69-75、80-95和115-120)，相反，二級結(jié)構(gòu)域?qū)涞男盘柋Ｗo(hù)則更好。以上研究表明，吸附態(tài)溶菌酶無規(guī)則片段去折疊程度更大，而二級結(jié)構(gòu)域受到保護(hù)。

這種由靜電作用介導(dǎo)的蛋白質(zhì)去折疊與由疏水作用和變性劑介導(dǎo)的去折疊區(qū)域有許多相似之處[20-24]，如二級結(jié)構(gòu)被保護(hù)，無規(guī)則結(jié)構(gòu)去折疊等。但去折疊程度明顯不同，對比本課題組研究溶菌酶在苯基瓊脂糖疏水介質(zhì)表面的去折疊發(fā)現(xiàn)[14]，靜電配基介導(dǎo)的溶菌酶殘基信號損失要明顯少于后者，這說明靜電作用導(dǎo)致的蛋白去折疊要弱于疏水作用對蛋白的破壞程度。

圖3 溶菌酶的2D1H-1H-TOCSY譜 (A: 天然態(tài)；B: 吸附態(tài))Fig. 3 2D 1H-1H-TOCSY NMR spectra of lysozyme. (A)Natural. (B)Adsorbed.

圖4 天然態(tài)和吸附態(tài)溶菌酶氫氘交換行為的比較 (H=α螺旋，S=β折疊)Fig. 4 Comparison of the H/D exchange behavior between natural and adsorbed lysozyme. H=helix; S=sheet.

2.3 溶菌酶與陽離子交換介質(zhì)的作用位點(diǎn)分析

詳細(xì)了解蛋白質(zhì)分子與介質(zhì)相互作用中起決定作用的綁定位點(diǎn)，對于深刻理解層析過程中蛋白質(zhì)與層析介質(zhì)微觀作用機(jī)理以及吸附劑的選擇、設(shè)計(jì)具有重要意義。離子交換色譜利用蛋白質(zhì)與離子交換介質(zhì)之間的靜電作用力的不同達(dá)到分離純化。對于陽離子交換介質(zhì)，由于帶負(fù)電荷，主要由蛋白表面帶正電荷的氨基酸與其發(fā)生靜電作用。此外，研究者利用核磁共振檢測到蛋白質(zhì)與固體介質(zhì)的作用界面的殘基酰胺氫信號保護(hù)程度大于溶液中殘基[25]。因此，可以確定蛋白與陽離子交換介質(zhì)的作用位點(diǎn)主要有3個(gè)特征：1)帶正電荷的氨基酸；2)蛋白表層的氨基酸；3)接觸面酰胺氫信號被保護(hù)的氨基酸。本研究擬依據(jù)這3個(gè)特征確定溶菌酶與陽離子交換介質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。

首先，為確定蛋白表層帶正電荷的氨基酸殘基，通過計(jì)算機(jī)分子模擬計(jì)算軟件 (Accelrys discovery studio)里的Delphi模塊計(jì)算出每個(gè)殘基的平均凈電勢，篩選出平均靜電勢大于0為帶正電荷的氨基酸殘基，然后，再從中篩選出SASA大于10%的殘基，SASA大于10%的殘基被認(rèn)為是溶劑可及殘基[26](圖5)。

其次，通過公式 (2)篩選出被接觸面保護(hù)的氨基酸。其中，I%為吸附前后蛋白的強(qiáng)度損失程度，當(dāng)I%值大于0時(shí)即為酰胺氫信號被保護(hù)的殘基 (圖 6A)。圖 6B為溶菌酶的氨基酸序列，其中被接觸面保護(hù)的殘基以斜體下劃線標(biāo)出，盡管這些氨基酸殘基序列并不依次相連，但在蛋白三維結(jié)構(gòu)中，大部分殘基在同一表面。

圖5 平均電勢和溶劑可及表面 (SASA)確定溶菌酶表面帶正電荷的殘基Fig. 5 Identif i cation of the exposed and positively charged residues on lysozyme according to residues’ mean potencial and SASA. The overlapping and approximate residues were labelled by‘/”.

圖6 吸附態(tài)溶菌酶殘基酰胺氫信號被保護(hù)程度 (A)和受到保護(hù)的氨基酸殘基 (B)Fig. 6 Protection against H/D exchange of adsorbed lysozyme (A), I%>0=Protected residues, I%<0=Non-protected residues; Residues are protected against H/D exchange of adsorbed lysozyme (B), italic and underlined fonts.

圖7 溶菌酶表面靜電勢分布及作用位點(diǎn) (紅色靜電勢小于零；藍(lán)色靜電勢大于零)Fig. 7 Electrostatic potential distributions and possible sites of binding on the lysozyme, surface from–5.0 kt/e (red)to +5.0 kt/e (blue).

最終，取帶正電荷的表層氨基酸與氫信號被保護(hù)的氨基酸之間的交集，篩選出溶菌酶與陽離子交換介質(zhì)的作用位點(diǎn)分別為Lys33、Arg114和Arg68 (圖 7)，這與研究者用熒光標(biāo)記賴氨酸測定的溶菌酶與相同陽離子交換介質(zhì) (即 SP Sepharose FF)的作用位點(diǎn)Lys33一致[27]。但由于熒光標(biāo)記法只能標(biāo)記賴氨酸一種帶正電荷的殘基，僅獲得了賴氨酸的綁定信息。此外，另一類常用技術(shù)是通過比較定點(diǎn)突變蛋白的保留時(shí)間差異來判斷介質(zhì)表面的綁定位點(diǎn)[5,28-29]，由于需要復(fù)雜的基因工程技術(shù)來構(gòu)建蛋白質(zhì)突變株，這些方法普遍存在如下問題：1)尋找存在突變株的蛋白較為困難，導(dǎo)致可研究的蛋白種類非常有限；2)沒有考慮當(dāng)引入兩個(gè)或多個(gè)取代殘基時(shí)蛋白三維結(jié)構(gòu)改變對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。相比而言，本研究利用H/D交換結(jié)合核磁共振技術(shù)，能夠彌補(bǔ)上述缺陷可獲得所有殘基包括帶同樣正電荷的精氨酸和組氨酸等的作用信息，并實(shí)現(xiàn)了原位標(biāo)記、實(shí)時(shí)、快速的表征介質(zhì)表面各種蛋白去折疊程度的信息。

3 結(jié)論

本研究利用氫氘交換結(jié)合 NMR技術(shù)表征了蛋白在離子交換介質(zhì)上的吸附過程。結(jié)果顯示，當(dāng)溶菌酶吸附到介質(zhì)表面之后，不同結(jié)構(gòu)片段的去折疊程度不同，無規(guī)則卷曲 (Coil，bend，and turn)片段酰胺氫信號更易失去即去折疊明顯，二級結(jié)構(gòu)域 (α-helix，β-sheet)對酰胺氫信號保護(hù)較好即去折疊較弱，表明靜電介導(dǎo)的蛋白去折疊呈局部分布。通過蛋白表面靜電勢模擬計(jì)算結(jié)合氫氘標(biāo)記的蛋白核核磁數(shù)據(jù)分析確定了溶菌酶與陽離子交換介質(zhì)的作用位點(diǎn)為Lys33、Arg114和Arg68。本研究提供了一條原位實(shí)時(shí)捕捉多孔介質(zhì)內(nèi)的蛋白結(jié)構(gòu)變化信息的新途徑，對于深刻理解層析過程中蛋白與層析介質(zhì)微觀作用機(jī)理具有重要意義，也為其他領(lǐng)域中蛋白質(zhì)與生物材料之間微觀界面研究提供了新的技術(shù)手段。

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