姚建新， 姚志峰， 李占峰， 劉永彪

蓽茇明堿（piplartine）又稱蓽茇酰胺（piperlongumine），化學(xué)名為 5，6 二氫-1-［1-氧代-3-（3，4，5-三甲氧基苯基）-2-丙烯基］-2（1H）吡啶酮，具有諸如鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗血小板凝集、抗真菌、抗血吸蟲、抗焦慮以及抗抑郁等多種藥理活性［1］。研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇明堿可顯著抑制乳腺癌［2］、前列腺癌［3］、白血病細(xì)胞［4］等多種實體瘤和 血 液 系 統(tǒng) 腫 瘤的生長增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［4-5］，并能干擾細(xì)胞周期進(jìn)程［3，5］，而腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞在增殖周期各時相的分布密切相關(guān)。本研究選擇三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為研究對象，觀察蓽茇明堿對該細(xì)胞放射敏感性的影響并探討可能機(jī)制，從而為今后臨床能使用蓽茇明堿作為放射增敏劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。采用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)液 （內(nèi)含青-鏈霉素100 u/ml），置于含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為單層貼壁生長。每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.1.2 藥物 蓽茇明堿由華東師范大學(xué)余家會課題組合成，用二甲基亞砜（DMSO）配成5 mmol/L的儲備液，過濾除菌，置于-20℃冰箱保存，使用時DMSO稀釋至＜0.1%。

1.1.3 試劑及儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青-鏈霉素溶液為GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；DMSO、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒為南京凱基公司產(chǎn)品；β-action抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體均購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；活性氧試劑盒為碧云天生物工程公司產(chǎn)品；Giemsa染液為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。余為國產(chǎn)分析純試劑。主要儀器有CO2培養(yǎng)箱（Heraeus公司）、流式細(xì)胞儀（FACScan，美國BD公司）和雙光子型醫(yī)用高能直線加速器（瑞典ELEKTA公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞照射 實驗分為單獨照射組和加藥照射組，均采用6 MV X線進(jìn)行不同劑量照射，劑量率為 300 cGy/min，源皮距（source skin distance，SSD）為100 cm，照射野為15 cm×15 cm，照射時機(jī)架角轉(zhuǎn)至180°，培養(yǎng)皿下墊1.5 cm厚的組織補(bǔ)償膠，單獨照射組和聯(lián)合處理組 （蓽茇明堿聯(lián)合照射組）的吸收劑量均為6 Gy。

1.2.2 克隆形成試驗 觀察蓽茇明堿對MDA-MB-231細(xì)胞的放射增敏效應(yīng)。取一定數(shù)量MDA-MB-231細(xì)胞置6 cm培養(yǎng)皿傳代，待細(xì)胞生長面積30%～40%時用于下一步試驗，每次試驗均取對數(shù)生長期細(xì)胞，以0.25%胰酶消化、離心并制成單細(xì)胞懸液。設(shè)立 3 個藥物濃度組（0、1、2.5 μmol/L），配置上述3種濃度的無血清培養(yǎng)液各100 ml，移走6 cm培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)液；分為3個濃度組，每個培養(yǎng)皿加入5 ml培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待蓽茇明堿作用于細(xì)胞24 h后，平均分組照射0、2、4、6和8 Gy的劑量。照射結(jié)束后，立即行細(xì)胞播種，根據(jù)不同的照射劑量接種不同數(shù)量的細(xì)胞，即按照200，500，1 000，2 000，4 000 個細(xì)胞對應(yīng) 0、2、4、6和8 Gy照射劑量進(jìn)行接種，每個劑量點設(shè)3個平行樣；各組細(xì)胞經(jīng)上述處理后在37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)14 d；當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)棄去培養(yǎng)基，用PBS漂洗后，無水乙醇固定15 min，棄固定液后Giemsa染液染色20 min，流水沖去染液，空氣干燥，顯微鏡下行克隆計數(shù)，計數(shù)≥50個細(xì)胞的克隆。試驗重復(fù)3次。按下列公式計算克隆形成率 （planting efficiency，PE）和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）。 PE（%）= 克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù) ×100%，SF=照射各劑量點PE/0 Gy PE×100%。為扣除蓽茇明堿本身作用對試驗結(jié)果的影響，本試驗以單獨加藥組的SF為基準(zhǔn)，對加藥照射組的SF進(jìn)行校正從而得到蓽茇明堿的放射增敏作用。

按多靶單擊模型SF=1-（1-e-D/D0）N使用SPSS 17.0中的非線性回歸法擬合細(xì)胞存活曲線，計算單獨照射組和加藥照射組的D0和Dq值，并計算放射增敏比（SER）。SERD0=單獨照射組D0/加藥照射組D0；SERDq= 單獨照射組 Dq/加藥照射組 Dq；SERSF2=單獨照射組SF2/加藥照射組SF2。

1.2.3 FCM檢測細(xì)胞凋亡 實驗分組如下：①空白對照組，未作處理；② 單獨加藥組，加入1 μmol/L蓽茇明堿；③ 單獨照射組，照射劑量為6 Gy；④ 加藥照射組，在相同劑量的照射前加入等體積的1 μmol/L蓽茇明堿。將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行上述處理后收集細(xì)胞，將細(xì)胞消化、懸浮，PBS洗滌離心，70%冷乙醇固定，-20℃保存過夜備用。重新收集細(xì)胞，取1×106個細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，棄固定液，2 ml PBS懸浮細(xì)胞，400目篩網(wǎng)過濾 1 次，1 000 r/min，離心 5 min，棄去 PBS，經(jīng)AnnexinV-FITC和PI雙染色，室溫避光染色30 min，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞凋亡率，數(shù)據(jù)獲取用 CELLQuest軟件，試驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 實驗分組如下：① 空白對照組，未作處理；② 單獨加藥組，加入濃度為2.5 μmol/L的蓽茇明堿；③ 單獨照射組，照射劑量為6 Gy；④ 加藥照射組，在相同劑量的照射前加入等體積的2.5 μmol/L蓽茇明堿。按上述分組處理后收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗2遍，離心。加適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心 20 min， 取上清液備用。按照Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白，并調(diào)整各組蛋白質(zhì)量濃度一致。蛋白提取物經(jīng)定量后，各組取等量蛋白加入等量10%SDS-PAGE上樣緩沖液，并置95～100℃水中變性5 min，行SDSPAGE垂直電泳，電轉(zhuǎn)PVDF膜，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜情況。加5%脫脂奶粉于4℃冷庫封閉過夜，TBST洗膜1.5 h后加一抗Bcl-2，Bax鼠抗人單克隆抗體，內(nèi)參照β-actin羊抗鼠單克隆抗體 （均為1∶1 000稀釋），過夜孵育（37℃孵育），TBST洗膜1.5 h后加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜 40 min后，ECL試劑顯色、曝光，并翻拍成照片。

1.2.5 FCM檢測細(xì)胞活性氧水平 2′，7′-二氯熒光黃 雙 乙 酸 鹽 （2′，7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）是非標(biāo)記性的氧化敏感的熒光探針，可了解細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，生長至90%融合時，按1.2.3要求進(jìn)行分組處理后吸出6孔板中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，收集1×106個經(jīng)上述處理的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基清洗3次。將上述細(xì)胞重懸于DCFH-DA（終濃度為 10 μmol/L）1 ml探針中，37℃避光孵育20 min后吸去染液，用不含EDTA的胰酶消化，PBS洗滌3次，300網(wǎng)過濾后，上FCM測定細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度，以488 nm為激發(fā)波長，525 nm為發(fā)射波長。以上試驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗和單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均以s表示，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)

按實驗分組要求處理各組細(xì)胞，扣除藥物本身作用對試驗結(jié)果的影響，相同照射劑量的加藥照射組SF均比單獨照射組低，兩組的SF差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)多靶單擊模型擬合的細(xì)胞存活曲線見圖1，表1示隨著蓽茇明堿濃度增加，D0、Dq和SF2均逐漸減小。

圖1 不同濃度蓽茇明堿聯(lián)合X射線照射后多靶單擊模型擬合的細(xì)胞存活曲線

表1 不同濃度蓽茇明堿聯(lián)合X射線照射后多靶單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線放射生物學(xué)參數(shù)

2.2 蓽茇明堿聯(lián)合X射線照射對細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)1 μmol/L蓽茇明堿處理后的細(xì)胞凋亡率為（7.5±0.60）%，經(jīng)6 Gy X射線單獨照射后的細(xì)胞凋亡率為（5.8±1.65）%，當(dāng)1 μmol/L蓽茇明堿和X線共同處理MDA-MB-231細(xì)胞后48 h，細(xì)胞凋亡率為（34.6±2.05）%，較蓽茇明堿組以及單獨X線照射組均有明顯增高，且高于兩者引起的凋亡率之和，與單獨照射組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05），表2、圖2、3。

表2 不同處理因素對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

表2 不同處理因素對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

注：與單獨加藥組相比，aP＜0.05；與單獨照射組細(xì)胞，bP＜0.05

組別 壞死細(xì)胞（Q1） 早期凋亡（Q2）正常細(xì)胞（Q3） 晚期凋亡（Q4）對照組 0.45±0.01 0.85±0.03 97.65±2.55 1.05±0.02單獨加藥組 1.55±0.05 4.50±0.35 90.95±3.42 3.00±0.46單獨照射組 0.98±0.06 3.20±0.65 93.30±1.48 2.60±0.48加藥照射組 2.58±0.08 18.40±1.05ab62.82±2.45 16.20±2.45ab

2.3 蓽茇明堿聯(lián)合X射線對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組細(xì)胞相比，單獨照射組和單獨加藥組細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)均有下降，Bax蛋白表達(dá)均有增加，Bcl-2與Bax的灰度比值均降低（P＜0.05）；蓽茇明堿單獨處理組細(xì)胞與單獨照射組細(xì)胞的Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)沒有明顯差異（P＞0.05）；而與對照組細(xì)胞和單獨照射組細(xì)胞相比，蓽茇明堿和X射線照射聯(lián)合處理組細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)有明顯的下降，Bax蛋白的表達(dá)有明顯的上升，Bcl-2與Bax的灰度比值均降低（P ＜ 0.05），圖 4、表 3。

圖2 各組細(xì)胞的凋亡情況±s，n=3）

圖3 各處理組細(xì)胞凋亡率

圖4 各處理組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表3 不同處理組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)（n=3，

表3 不同處理組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)（n=3，

注：與對照組相比，aP＜0.05；與單獨照射組相比，bP＜0.05；與單獨加藥組相比，cP＜0.05

組別 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax對照組 1.55±0.09 0.42±0.02 3.69±0.15單獨照射組 1.43±0.02a 0.74±0.1a 1.93±0.27a單獨加藥組 1.19±0.03ab 0.82±0.07ab 1.45±0.05ab加藥照射組 0.72±0.08abc 0.48±0.05abc 0.49±0.07abc

2.4 蓽茇明堿聯(lián)合X射線對細(xì)胞活性氧水平的影響

裝載探針的各組細(xì)胞均檢測到熒光，與對照組相比，單獨加藥組（1 μmol/L）與單獨照射組（6 Gy）細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），而加藥照射組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度與其他各組相比均顯著提高（P<0.05），圖 5。

圖5 各處理組細(xì)胞活性氧水平

3 討論

三陰性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER-2）均為陰性的一種特殊類型乳腺癌，其對內(nèi)分泌治療和分子靶向藥物曲妥珠單抗均無效［6］。由于TNBC細(xì)胞含有突變型p53（mtp53），該型乳腺癌對臨床放療的敏感性較其他類型差［7］。

蓽茇明堿對多種腫瘤細(xì)胞具有特異性的細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞沒有明顯毒性作用［8-9］。蓽茇明堿在體外能抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)一定的濃度、時間依賴關(guān)系［2］。DNA是X線殺傷腫瘤細(xì)胞的主要靶點，因此基于靶學(xué)說的多靶單擊模型SF=1-（1-e-D/D0）N在放射生物學(xué)領(lǐng)域被廣泛用于衡量細(xì)胞的放射敏感性［10］。 本研究結(jié)果表明，加藥照射組 D0、Dq和 SF2較單獨照射組均降低（P<0.05，表 1），D0減小，意味著在相對高劑量區(qū)，蓽茇明堿增加了細(xì)胞的放射敏感性，Dq值減小，意味著在很小劑量的照射就可使細(xì)胞進(jìn)入致死性損傷的指數(shù)性存活曲線部分。本實驗中，1 μmol/L及 2.5 μmol/L的蓽茇明堿放射增敏比（SERD0）分別為 1.22 和 1.29。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤受電離輻射后，凋亡反應(yīng)的增加與放射敏感性的提高成正相關(guān)［11］。本研究結(jié)果表明，單獨蓽茇明堿預(yù)處理并沒有提高細(xì)胞的凋亡率，而聯(lián)合X線照射后，則明顯增加了照射引起的晚期凋亡和早期凋亡。由此可見，低細(xì)胞毒濃度的蓽茇明堿雖然本身不誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，但可能通過影響凋亡相關(guān)的調(diào)控途徑來增加放射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

在細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因中，Bcl-2家族是目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系密切的原癌基因之一［12］。Kong等［3］研究證實了蓽茇明堿能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蓽茇明堿未明顯改變Bax的表達(dá)，但使Bcl-2表達(dá)下降，Bax/Bcl-2比值下降。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蓽茇明堿和X線照射聯(lián)合處理組Bax表達(dá)水平明顯高于對照組和單獨處理組，而Bcl-2的表達(dá)明顯低于對照組和單獨處理組，Bax/Bcl-2增加，而腫瘤細(xì)胞Bax/Bcl-2的表達(dá)程度與其放射敏感性呈正相關(guān)，說明了蓽茇明堿可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)表現(xiàn)出放射增敏效應(yīng)的。

有研究提示氧化應(yīng)激是一種普遍的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子，其參與了細(xì)胞凋亡的過程，并起了關(guān)鍵作用。為了減少有氧代謝過程中活性氧（ROS）對細(xì)胞的損害，正常細(xì)胞自身具有一系列有效的抗氧化防御系統(tǒng)，是機(jī)體參與消除氧自由基的主要生物分子，能夠通過不斷清除細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平動態(tài)平衡，被認(rèn)為是腫瘤抗輻射的物質(zhì)基礎(chǔ)。

在蓽茇明堿誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的過程中，ROS水平升高，并與濃度呈正相關(guān)［2］。本實驗結(jié)果證實蓽茇明堿可通過提高射線照射后MDAMB-231細(xì)胞內(nèi)ROS的水平發(fā)揮增敏作用。有研究證實，Bcl-2能抗過氧化反應(yīng)保護(hù)脂質(zhì)膜、保持細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)［13］。因此提出Bcl-2是一種抗氧化劑，可通過抗氧化劑的作用或通過抑制氧自由基的產(chǎn)生而抑制細(xì)胞死亡的觀點。本研究表明，蓽茇明堿聯(lián)合X線照射明顯降低Bcl-2的表達(dá)的同時，也明顯增加胞內(nèi)ROS水平，從而明顯增加細(xì)胞凋亡。我們推測，活性氧應(yīng)激途徑與細(xì)胞凋亡調(diào)控途徑似乎存在某種內(nèi)在聯(lián)系，這或許正是值得進(jìn)一步研究之處。

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