閻 賀, 張永平, 徐淑娟, 高 濤, 譚慎興, 楊彪炳

實(shí)驗(yàn)研究

脂肪來源干細(xì)胞對(duì)兔皮膚組織擴(kuò)張后回縮率的影響

閻 賀, 張永平, 徐淑娟, 高 濤, 譚慎興, 楊彪炳

目的探討在皮膚組織擴(kuò)張過程中注射脂肪來源干細(xì)胞對(duì)擴(kuò)張皮瓣回縮率的影響。方法取健康新西蘭大白兔的脂肪，體外分離、培養(yǎng)并傳代脂肪來源干細(xì)胞，行免疫細(xì)胞化學(xué)表面標(biāo)志物及表皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定，并利用EdU染色對(duì)脂肪來源干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記；20只新西蘭大白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各10只；在兔背部埋置一30 ml擴(kuò)張器；實(shí)驗(yàn)組在擴(kuò)張皮下注射1 ml脂肪來源干細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為5×106/ml；對(duì)照組僅注射1 ml無血清DMEM培養(yǎng)基；常規(guī)組織擴(kuò)張至預(yù)期容量；切取擴(kuò)張組織，觀察切片厚度及組織學(xué)變化；計(jì)算兩組回縮率并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；采用免疫組化染色對(duì)組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物(CD31)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張皮瓣回縮率明顯降低(P<0.05)；組織學(xué)顯示，實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張皮膚厚度大于對(duì)照組(P<0.05)；免疫組化顯示，實(shí)驗(yàn)組CD31、VEGF表達(dá)量增多，毛細(xì)血管增生明顯。結(jié)論脂肪來源干細(xì)胞能夠促進(jìn)新生血管生成及皮膚組織再生，很大程度地減少了擴(kuò)張皮膚組織的回縮率，從而提高了皮膚擴(kuò)張效率。

脂肪來源干細(xì)胞; 皮膚擴(kuò)張; 回縮率; 血管生成

目前，皮膚軟組織擴(kuò)張技術(shù)已廣泛應(yīng)用于整形外科。然而，擴(kuò)張的皮瓣因其近期和遠(yuǎn)期的回縮往往難以達(dá)到預(yù)期的效果。因此，尋找一種能夠減少皮瓣回縮的有效方法，具有重要的臨床意義。脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells， ADSCs)是從脂肪組織分離出來的多能干細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后，可以向骨、軟骨、脂肪等間充質(zhì)細(xì)胞甚至上皮細(xì)胞分化[1-2]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討在皮膚擴(kuò)張過程中，通過注入脂肪來源干細(xì)胞促進(jìn)新生皮膚組織再生，從而降低回縮率的可能性，為建立更適應(yīng)于臨床的皮膚擴(kuò)張模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6個(gè)月齡雄性新西蘭大白兔20只，體質(zhì)量2～3 kg，購自濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 30 ml硅橡膠軟組織皮膚擴(kuò)張器(余姚市久盛硅橡膠制品廠);EdU試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.3 ADSCs的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定 取大白兔新鮮脂肪，放置于無菌盤中，用PBS緩沖液沖洗，去除紅細(xì)胞和組織碎片，剪碎至細(xì)小顆粒狀，1200 r/min離心5 min，消化，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心，棄上清，留貼壁細(xì)胞；用低糖DMEM培養(yǎng)液重懸并接種至培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)特征。用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)ADSCs表面特異性標(biāo)記物CD34、CD44、CD29及CD106；經(jīng)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor， EGF)誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞表型分化，并鑒定其CK19的表達(dá)。

1.4 EdU標(biāo)記ADSCs 使用第3 代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為1×105/孔，培養(yǎng)至生長(zhǎng)階段。用10 μM 濃度的EdU標(biāo)記ADSCs，并孵育12 h。按照EdU試劑盒染色步驟進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 擴(kuò)張模型的建立 將20只大白兔隨機(jī)分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各10只。3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉。術(shù)區(qū)脫毛、消毒、鋪巾。于大白兔背部垂直于脊柱方向切開約2 cm長(zhǎng)的切口，在淺筋膜深層剝離出一腔隙，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均置入30 ml腎形擴(kuò)張器,向擴(kuò)張囊內(nèi)注入20 ml生理鹽水，使之充盈，嚴(yán)密縫合傷口。術(shù)后肌注青霉素40萬u，以防感染。將經(jīng)EdU標(biāo)記的第3代ADSCs，經(jīng)胰酶消化分離，用無血清DMEM配制成濃度為5×106/ml的細(xì)胞懸液。在實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張皮下注入ADSCs懸液1 ml；對(duì)照組僅注射無血清DMEM培養(yǎng)基1 ml。1周后傷口愈合拆線，拆線后開始注水，每3天注水1次，每次10 ml，最終注水量120 ml,4周后完成擴(kuò)張(圖1)。

1.6 皮膚回縮率的計(jì)算以及組織學(xué)觀察 在取出擴(kuò)張器之前，在擴(kuò)張皮瓣頂部正中央部位標(biāo)記一個(gè)2.5 cm×2.5 cm的方格，并對(duì)其照相。取出擴(kuò)張器后，將標(biāo)記部位切下放置于玻璃上, 待其自由回縮完全后，再對(duì)其照相。用圖像分析軟件對(duì)擴(kuò)張皮膚組織收縮前后的面積進(jìn)行測(cè)量。同時(shí)將擴(kuò)張皮瓣放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟組織切片，HE染色并進(jìn)行組織學(xué)觀察。在低倍光鏡下，用顯微測(cè)量尺對(duì)皮膚組織切片全層厚度進(jìn)行測(cè)量并對(duì)比。

1.7 ADSCs細(xì)胞示蹤及免疫組織化學(xué)檢查 對(duì)擴(kuò)張皮膚組織進(jìn)行常規(guī)石蠟組織切片，按照EdU試劑盒方法，對(duì)切片染色并用熒光顯微鏡觀察。采用免疫組織化學(xué)染色，對(duì)組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)和內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物(CD31)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 原代細(xì)胞6～8 h開始貼壁生長(zhǎng)，24 h后貼壁細(xì)胞充分伸展，培養(yǎng)至第3代，細(xì)胞鋪滿瓶底，排列較整齊，并形成集落,彼此融合呈長(zhǎng)梭形分布。 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，ADSCs特異性標(biāo)志物CD44、CD29陽性表達(dá)，而造血系統(tǒng)相關(guān)抗原CD34、CD106則為陰性表達(dá)。ADSCs向表皮細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果顯示，CK19陽性表達(dá)。

2.2 EdU標(biāo)記ADSCs 在共聚焦顯微鏡下觀察可見，被EdU染色的細(xì)胞核呈紅色，經(jīng)Hoechst染色的背景細(xì)胞呈藍(lán)色，將兩者重疊后呈現(xiàn)橙紅色，這表明EdU成功標(biāo)記ADSCs(圖2)。

2.3 擴(kuò)張皮膚回縮率 兩組擴(kuò)張皮膚離體后均有回縮，實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張皮膚回縮率明顯小于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 皮膚擴(kuò)張后兩組回縮率

組別組織離體前面積/mm2組織離體后面積/mm2回縮率(%)實(shí)驗(yàn)組630．43±36．52451．38±24．5528．07±7．44?對(duì)照組625．79±18．51307．77±21．9450．60±3．89

注：n=10，*與對(duì)照組比較P<0.05

2.4 ADSCs在擴(kuò)張皮膚中的轉(zhuǎn)歸及組織學(xué)檢查 在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)EdU標(biāo)記的紅色熒光細(xì)胞參與了皮膚結(jié)構(gòu)的生成；組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，兩組皮膚擴(kuò)張后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組皮膚增厚更加明顯，尤其是表皮層(表2,圖3,4)。膠原纖維排列疏松，纖維間隙增加，偶見膠原纖維斷裂；免疫組織化學(xué)顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)量增加，微小血管密度增加，內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD31表達(dá)量增加(圖5)。

表2 皮膚擴(kuò)張后兩組皮膚厚度

組別擴(kuò)張后全層皮膚厚度/mm擴(kuò)張后表皮厚度/μm實(shí)驗(yàn)組4．11±0．14?137．20±2．34?對(duì)照組2．89±0．16113．17±6．11

注：n=10,*與對(duì)照組比較P<0.05

3 討論

皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)最早由CG Neumann應(yīng)用于臨床并獲得成功,現(xiàn)已成為整形外科手術(shù)中尤為重要的一種技術(shù)手段。根據(jù)皮膚擴(kuò)張研究理論，皮膚組織擴(kuò)張是一種復(fù)雜的機(jī)械應(yīng)力過程，其中，額外皮膚的產(chǎn)生主要來自新生皮膚再生[3]，以此來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)張效應(yīng)。在皮膚牽拉過程中,容易產(chǎn)生一種類似創(chuàng)傷的微環(huán)境[4]，由于皮膚再生能力有限，單純的增加皮膚機(jī)械應(yīng)力很難促進(jìn)皮膚組織生長(zhǎng)，且易導(dǎo)致皮膚組織更大回縮，甚至壞死。因此，我們嘗試通過局部注射ADSCs的方法，促進(jìn)皮膚再生，降低皮膚回縮率，從而增加皮膚組織擴(kuò)張效率。近年來，已報(bào)道了許多提高皮膚擴(kuò)張效率的方法。1985年，P Lee等研究了藥物罌粟堿對(duì)組織擴(kuò)張皮瓣的影響，他發(fā)現(xiàn)使用罌粟堿可以通過增加擴(kuò)張皮瓣的血流量來提高皮膚擴(kuò)張效率；欒杰等[5]也發(fā)現(xiàn)，外用罌粟堿霜可以提高皮膚組織擴(kuò)張效率，縮短擴(kuò)張時(shí)間，增加擴(kuò)張皮瓣的成活長(zhǎng)度；另外，二甲基亞砜[6]、類固醇類和茶堿類藥物[7]也被證實(shí)能夠加速組織擴(kuò)張。然而，這些藥物的不良反應(yīng)限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

干細(xì)胞技術(shù)目前正以其無可比擬的優(yōu)越性，被應(yīng)用于多種臨床治療及研究。同其他干細(xì)胞相比，ADSCs具有來源豐富、易于獲得以及低免疫原性[8]等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討通過局部注射ADSCs，增加擴(kuò)張皮膚血管再生及新生組織形成，從而降低擴(kuò)張皮膚回縮率的可能性。據(jù)報(bào)道，ADSCs在體外可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞，將ADSCs放在添加了甲基纖維素和VEGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)有內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31的表達(dá)[9]；ADSCs在無血清培養(yǎng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)后，CD31表達(dá)量明顯增加，這表明其能夠向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[10]；還有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪來源干細(xì)胞在VEGF、bFGF誘導(dǎo)下，能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞[11]，這為ADSCs在體內(nèi)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)新生血管的形成，提供了一定的理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面， ADSCs局部應(yīng)用可促進(jìn)缺血皮瓣毛細(xì)血管增生，減少缺血皮瓣的壞死，明顯提高皮瓣的成活率[12]；更有學(xué)者展望,將ADSCs應(yīng)用于難愈性創(chuàng)面的治療[13]。這些都表明，ADSCs對(duì)組織再生、修復(fù)具有重要的臨床意義。

圖1 皮膚組織擴(kuò)張模型圖2 標(biāo)記ADSCs (×200) a.Edu標(biāo)記ADSCs b.Hoechst標(biāo)記ADSCs c.兩者重疊圖3 擴(kuò)張皮膚組織(HE ×50) a.實(shí)驗(yàn)組 b.對(duì)照組圖4 擴(kuò)張皮膚組織(HE ×200) a.實(shí)驗(yàn)組 b.對(duì)照組圖5 實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張皮膚免疫組化 (SP ×400) a.VEGF表達(dá) b.CD31表達(dá)

Fig1 Expansion model of skin tissue.Fig2 Labeled ADSCs (Confocal microscopy ×200). a. ADSCs labeled with EdU. b. ADSCs labeled with Hoechst. c. Overlap of EdU and Hoechst.Fig3 Tissue after skin expansion (HE ×50). a. experimental group. b. control group.Fig4 Tissue after skin expansion (HE ×200). a. experimental group. b. control group.Fig5 Immunohistochemistry of expanded skin in the experimental group (SP ×400) a. the expression of VEGF. b. the expression of CD31.

我們采用皮下局部注射ADSCs，可聚集更高濃度的細(xì)胞，更有利于ADSCs 發(fā)揮作用。免疫組織化學(xué)顯示，實(shí)驗(yàn)組血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD31的表達(dá)量增加，說明了ADSCs在皮膚擴(kuò)張過程中，至少有一部分轉(zhuǎn)化成了內(nèi)皮細(xì)胞。這些新生的內(nèi)皮細(xì)胞參與了新生血管壁結(jié)構(gòu)的形成，從而保證了擴(kuò)張皮膚更好的血液供應(yīng)，對(duì)新生組織的營(yíng)養(yǎng)支持具有重要意義。VEGF表達(dá)量增多也說明了這一點(diǎn)，以往研究證明，ADSCs 能夠分泌VEGF等各種生長(zhǎng)因子[14]。ADSCs通過不斷分泌VEGF,在擴(kuò)張皮膚再生過程發(fā)揮重要作用。VEGF還可以通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管來促進(jìn)血管增生，并通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化，從而促進(jìn)新生血管形成。眾所周知，被擴(kuò)張的皮膚組織越薄，回縮率越大；反之，皮膚組織越厚，其回縮率就會(huì)越小。組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張皮膚厚度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組，且表皮增厚更加明顯，相對(duì)于對(duì)照組表現(xiàn)出更強(qiáng)的皮膚組織再生能力。

為了探尋ADSCs最終的分化方向，我們對(duì)移植的ADSCs進(jìn)行EdU標(biāo)記。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測(cè)方法相比，EdU標(biāo)記更加簡(jiǎn)便，且對(duì)細(xì)胞影響小[15-16]。有報(bào)道稱，EdU最佳標(biāo)記濃度是10 μM,12 h[17]。因此，我們采用10 μM的最佳濃度進(jìn)行標(biāo)記。熒光顯微鏡顯示，EdU標(biāo)記的ADSCs主要集中在真皮、皮下組織，說明ADSCs參與了皮膚的再生過程。

然而，本實(shí)驗(yàn)并沒有研究ADSCs對(duì)擴(kuò)張皮瓣的遠(yuǎn)期效果，這需要我們進(jìn)一步地長(zhǎng)期觀察研究；此外，皮膚組織擴(kuò)張器置入體內(nèi)，作為一種外來異物，大多會(huì)誘發(fā)異物排斥反應(yīng)，通過介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致纖維包膜的形成，這會(huì)對(duì)機(jī)械擴(kuò)張產(chǎn)生一種反牽拉的力。雖然ADSCs在擴(kuò)張過程中能夠促進(jìn)皮膚組織再生，減少回縮率，但是纖維包膜的形成，還是會(huì)對(duì)組織擴(kuò)張效率造成很大的影響。如何更有效地抑制纖維包膜形成，有待我們進(jìn)一步研究。

綜上所述，在皮膚軟組織擴(kuò)張中，ADSCs是一種很有前途的治療方法，對(duì)提高皮膚擴(kuò)張效率，減少皮膚回縮率，有著重要的臨床意義。雖然目前有很多方法可以促進(jìn)擴(kuò)張皮膚組織再生，但ADSCs對(duì)皮膚再生發(fā)揮的作用及效果更加明顯直接，這也為今后的臨床實(shí)際應(yīng)用提供了參考。

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Effectofadipose-derivedstemcellsontheretractionrateafterskintissueexpansioninrabbit

YANHe,ZHANGYong-ping,XUShu-juan,etal.

(WeifangMedicalUniversity，Weifang261053，China)

ObjectiveTo investigate the effect of adipose-derived stem cells (ADSCs) on the retraction rate after skin tissue expansion in rabbit.MethodsFat isolated from healthy rabbits was isolated, cultured and then generated in vitro for 3 passages into the ADSCs. The characterizations of ADSCs were determined by their surface markers and their ability to differentiate into epidermal cells. The ADSCs were marked by EdU. Twenty rabbits were randomly divided into experimental and control groups, 10 rabbits for each group. A tissue expander (30 ml) was buried in the back of the rabbit with 5×106/ml ADSCs (1 ml) subcutaneous injection in the experimental group and only 1ml serum-free DMEM injection the control group, respectively. The tissue was expanded conventionally to expected capacity. The retraction rates in the 2 groups were calculated and statistically analyzed. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of endothelial cell marker (CD31) and vascular endothelial growth factor (VEGF).ResultsCompared with the control group, skin retraction rate in the experimental group was significantly lower (P<0.05). Immunohistochemical staining showed that CD31, VEGF expression increased in the experimental group, and also demonstrated a significant increase in capillary density.ConclusionIt suggests that ADSCs can promote neovascularization and skin tissue regeneration and significantly reduce the retraction rate of the skin tissue, thereby increasing the efficiency of skin expansion.

Adipose derived stem cells; Skin expansion; Retraction rate; Angiogenesis

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.06.019

R318;R622

A

1673-7040(2014)06-0370-04

2014-03-02)

濰坊醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新研究基金資助項(xiàng)目(K11TS1006)

261053 山東 濰坊，濰坊醫(yī)學(xué)院(閻 賀，張永平，徐淑娟，高 濤，譚慎興)；濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院 整形外科(楊彪炳)

閻 賀(1989-)，男，山東省淄博人，碩士研究生.

楊彪炳，261053,濰坊醫(yī)學(xué)院 整形外科醫(yī)院,電子信箱:ybiaobing@163.com