劉 肅， 樊亞紅， 趙彩玲， 陳振雨， 柳大烈

實驗研究

二甲氨基乙醇和復(fù)方氨基酸溶液對衰老大鼠皮膚MMP-1和TIMP-1mRNA表達的影響

劉 肅， 樊亞紅， 趙彩玲， 陳振雨， 柳大烈

目的依據(jù)Mesotherapy的治療理念，觀察真皮內(nèi)注射二甲氨基乙醇(DMAE)和復(fù)方氨基酸溶液(AA)對D-半乳糖誘導的化學性衰老大鼠皮膚MMP-1和TIMP-1mRNA表達的影響。方法80只wistar大鼠隨機分入正常對照組、衰老對照組、衰老治療組。衰老治療組從注射D-半乳糖后第18天開始，在大鼠兩側(cè)臀部皮膚分別皮內(nèi)注射0.2%DMAE+AA、0.1%DMAE+AA、0.2%DMAE、0.1%DMAE、AA、生理鹽水(NS)，每周1次，連續(xù)4周。觀察各組皮膚組織學、真皮厚度、羥脯氨酸(Hyp)、MMP-1、TIMP-1 mRNA和成纖維細胞核增殖抗體(PCNA)表達水平的變化。結(jié)果真皮內(nèi)注射0.1%DMAE+AA、0.2%DMAE+AA，可使衰老大鼠真皮厚度、Hyp含量和MMP-1mRNA表達水平顯著增加，而對TIMP-1mRNA和PCNA的表達沒有影響。結(jié)論在衰老大鼠真皮內(nèi)注射0.2%DMAE+AA、0.1%DMAE+AA，可促進老化、變性膠原蛋白分解，重構(gòu)衰老皮膚組織結(jié)構(gòu)，使皮膚中膠原蛋白含量顯著增多，真皮厚度增加，具有一定延緩皮膚衰老的作用。

二甲氨基乙醇； 復(fù)方氨基酸； MMP-1； TIMP-1； Mesotherapy

本研究以D-半乳糖誘導的亞急性化學性大鼠衰老皮膚模型為研究對象[1]，依據(jù)Mesotherapy的治療理念，分別在衰老大鼠臀部皮膚真皮內(nèi)注射0.2%二甲氨基乙醇 (dimethylaminoethano， DMAE)+復(fù)方氨基酸溶液(amino acid, AA)、0.1%DMAE+AA、0.2%DMAE、0.1%DMAE、AA和生理鹽水(Normal saline，NS)，以研究其對皮膚MMP-1和TIMP-1mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡清潔級雄性wistar 大鼠 80只 ,體質(zhì)量(200±20)g,由青島市藥物研究中心提供。

1.2 主要實驗儀器 RT PCR分析儀(寶生物工程大連有限公司)、超聲細胞粉碎儀(SONICS公司， 美國)、Neofuge 13R低溫高速離心機(上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)。

1.3 主要試劑 DMAE、D-半乳糖(國藥集團化學試劑有限公司)；3.48%AA(廣東利泰藥業(yè)有限公司)；羥脯氨酸(hydroxyproline， Hyp)劑盒(南京建成生物科技公司)；MMP-1、TIMP-1和內(nèi)參照β-action引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；PCNA試劑盒(PROTEINTECH公司,美國)。

1.4 實驗動物分組及處理 實驗動物分組情況見表1。預(yù)處理：1～7組大鼠每天注射D-半乳糖125 mg/kg，共42 d； 2～7組大鼠在18 d予10%水合氯醛麻醉,5%硫酸鈉脫毛，在臀部兩側(cè)制作直徑3 cm的圓形文身，于文身皮膚真皮層多點均勻注射相應(yīng)治療試劑1 ml。每周1次，連續(xù)4周。衰老對照組和正常對照組只做相同的抓取和麻醉。所有動物自由取食、飲水。42 d后，切取皮膚標本，留小部分制作石蠟切片，其余組織迅速置于液氮冰凍保存。

表1 實驗動物分組及處理

1.5 Hyp含量測定 大鼠皮膚Hyp含量的測定參照南京建成生物工程公司試劑盒說明書進行。

1.6 Real Time-PCR試驗步驟 ①提取總RNA；②逆轉(zhuǎn)錄； ③PCR 擴增: PCR反應(yīng)總體系為20 μl, 含cDNA 2 μl 、ROX Reference Dye 0.4 μl、 Taq 酶 10 μl 、dd H2O 6 μl 、 上游和下游引物各 0.8 μl。引物序列如下。MMP-1,上游引物:5.-ctcccttggactcactcattcta-3.,下游引物:5.-agaacatcacctctcccctaaac-3.,產(chǎn)物長度227 bp；TIMP-1,上游引物:5.-tggcatcctcttgttgctatc-3.,下游引物:5.-cgaatcctttgagcatcttagtc-3.,產(chǎn)物長度191 bp ;內(nèi)參照 β-action,上游引物:5.-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3.,下游引物: 5.-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3.,產(chǎn)物長度150 bp。擴增條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s，PCR反應(yīng)95 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s (40個循環(huán) )。結(jié)果采用2-△△CT方法分析基因表達數(shù)據(jù)。

1.7 測量方法 采用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)，在4×10倍數(shù)下測量真皮厚度，真皮層厚度為真皮乳頭和表皮突到淺筋膜層距離的平均值；在40×10放大倍數(shù)下，對PNCA免疫組化染色皮膚切片中呈陽性染色的成纖維細胞進行測量。相同倍鏡下，每個病理切片隨機選取5個視野，每個視野隨機選取5處進行測量，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 動物外觀 衰老各組大鼠體質(zhì)量減輕，體形瘦小，毛色枯黃，活動減少，行動遲緩，精神萎靡，具有老化的特征。正常組大鼠體形明顯大于衰老各組大鼠，毛色光澤且多動活潑。

2.2 組織學差異 與正常對照組相比，衰老各組表現(xiàn)為表皮變薄，細胞層數(shù)減少，真皮變薄，皮膚膠原纖維排列疏松，膠原纖維密度降低，膠原束細長、斷裂、走向平直。其中，衰老0.1% DMAE+AA組、衰老0.2%DMAE+AA組上述現(xiàn)象好于衰老對照組(圖1)。

2.3 真皮厚度 與衰老對照組相比，衰老0.1%DMAE+AA組和衰老0.2%DMAE+AA組真皮厚度較高(P<0.01)；與正常對照組相比，所有衰老組的真皮厚度均較低(P<0.01)，見表2。

2.4 Hyp含量 與其他衰老組相比，正常對照組、衰老0.1% DMAE+AA組、衰老0.2%DMAE+AA組皮膚中Hyp含量均較高(P<0.05)；正常對照組與衰老0.2%DMAE+AA組、衰老0.2%DMAE+AA組與衰老0.1% DMAE+AA組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.5 DMAE和AA對MMP-1 、TIMP-1mRNA表達水平的影響 與衰老對照組相比，正常對照組、衰老0.1% DMAE+AA組、衰老0.2%DMAE+AA組皮膚中MMP-1 mRNA表達水平較高(P<0.01)。與衰老0.2%DMAE+AA組相比，正常對照組和衰老0.1% DMAE+AA組皮膚中MMP-1 mRNA表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而其他衰老各組表達水平均較低(P<0.01)。正常對照組TIMP-1的mRNA表達水平顯著高于衰老各組(P<0.01)，而衰老各治療組表達水平的差異均無顯著性意義(P>0.05)。見表2，圖1。

2.6 DMAE和AA對成纖維細胞PCNA表達的影響 正常對照組PCNA的表達高于衰老各組(P<0.01)；衰老各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

3 討論

Mesotherpy通過直接在真皮層注射具有良好的生物相容性和能夠完全吸收的合適產(chǎn)品，來維護或者恢復(fù)健康、青春的皮膚紋理，從而達到美容、抗衰老的效果。它不但顯效快，療效明顯，而且微創(chuàng)、恢復(fù)期短，受到廣大愛美人士和整形醫(yī)師的歡迎。但對于其確切的療效及明確的作用機制，文獻報道亦不多[2-4]，還有部分學者認為該方法不具有抗衰老的作用[5-6]。

DMAE是維生素B膽堿的類似物，是乙酰膽堿的前體。臨床試驗發(fā)現(xiàn)，外用3%DMAE凝膠16周，可明顯改善前額皺紋、眶周細紋、唇的厚度和形狀外觀，并驗證了連續(xù)應(yīng)用12個月的安全性[7]。外用3%DMAE凝膠，可使皮膚超聲剪切波速度增加，提示其可增加皮膚的緊實度[8]。但亦有文獻報道，2.5～10.0 mmol/L的DMAE即可導致培養(yǎng)的兔成纖維細胞內(nèi)產(chǎn)生大量空泡；3%(337 mmol/L)DMAE外用也能引起兔耳表皮細胞的空泡化[9]；并發(fā)現(xiàn)DMAE可抑制培養(yǎng)的成纖維細胞增殖，加劇凋亡，認為較高濃度的DMAE具有一定的細胞毒性[10]。目前，臨床應(yīng)用的DMAE均為外用品，其大劑量用藥不但增加其相應(yīng)的不良反應(yīng)和毒性，也增加了醫(yī)療負擔。因此，本研究依據(jù)Mesotherapy的治療理念，通過真皮內(nèi)注射小劑量、低濃度的DMAE，直接作用于擬治療的部位，降低其濃度和用量，同時還結(jié)合AA同步注射，以減輕真皮內(nèi)注射DMAE對靶細胞的細胞毒性，并為其提供多種氨基酸作為營養(yǎng)物質(zhì)。

圖1 各治療組組織學變化(HE ×40) a.衰老對照組 b.衰老NS組 c.衰老AA組 d.衰老0.1%DMAE組 e.衰老0.2%DMAE組 f.衰老0.1%DMAE+AA組 g.衰老0.2%DMAE+AA組 h.正常對照組

Fig1 Histological changes in each group (HE ×40). a. aging control group. b. aging NS group. c. aging AA group. d. aging 0.1%DMAE group. e. aging 0.2%DMAE group. f. aging 0.1%DMAE+AA group. g. aging 0.2%DMAE+AA group. h. normal control group.

表2 各組真皮厚度、Hyp含量以及MMP-1、TIMP-1mRNA、PCNA的表達情況

本研究結(jié)果表明，D半乳糖誘導的衰老對照組大鼠皮膚真皮厚度、Hyp的含量、成纖維細胞PCNA的表達、MMP-1、TIMP-1mRNA的表達均顯著低于正常大鼠，在組織學、細胞增殖和膠原代謝方面均呈現(xiàn)老化的特征，說明本研究應(yīng)用D半乳糖125 mg/kg.d在大鼠頸背部皮下注射連續(xù)42 d，大鼠皮膚亞急性化學性衰老模型造模成功。

MMP-1(基質(zhì)金屬蛋白酶)在正常休眠組織中表達水平極低，主要在組織生長、創(chuàng)傷愈合、修復(fù)、重構(gòu)期間表達增加。TIMP(基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑)是MMP的天然抑制物[11]。本研究結(jié)果顯示，真皮內(nèi)注射0.1%DMAE+AA和0.2%DMAE+AA能顯著上調(diào)衰老大鼠皮膚中的MMP-1 mRNA表達水平，顯著提高衰老皮膚中Hyp的含量，增加真皮厚度，其中0.2%DMAE+AA復(fù)合溶液的作用更為顯著，而這兩組TIMP-1 mRNA的表達水平顯著低于正常對照組，提示這兩組藥物可促進衰老皮膚中膠原的分解代謝，使老化、變性膠原降解，修復(fù)、重新構(gòu)建衰老皮膚的結(jié)構(gòu)，并同時使其膠原蛋白含量增加，接近或達到正常健康大鼠生長水平。組織學上表現(xiàn)為衰老的大鼠真皮厚度增加，膠原纖維豐富，排列致密，呈波紋狀，具有恢復(fù)皮膚年輕狀態(tài)的組織結(jié)構(gòu)特點。說明這兩組復(fù)合藥物具有延緩皮膚老化的作用。PCNA在細胞增殖的啟動上發(fā)揮重要作用，可作為判斷細胞增殖狀態(tài)的一個指標[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老各治療組成纖維細胞PCNA的表達，與衰老對照組無顯著差別，提示真皮內(nèi)注射上述各組藥物無誘導衰老大鼠皮膚成纖維細胞增殖的作用，無細胞過度增殖產(chǎn)生變異和癌變的隱患。

采用相同的方法，單獨在衰老大鼠真皮內(nèi)注射0.2%DMAE、0.1%DMAE、AA、NS，無論是組織學表現(xiàn)、真皮厚度，還是Hyp含量以及MMP-1mRNA表達水平，與衰老空白組的差異均無統(tǒng)計學意義，但均明顯低于正常對照組和0.2%DMAE+AA組、0.1%DMAE+AA組。說明單用DMAE和AA無效，只有兩者結(jié)合，才具有延緩皮膚衰老的功效。

本研究依據(jù)Mesotherapy的治療理念，在皮膚內(nèi)定位、定量注射抗衰老藥物，改善皮膚膠原代謝，并不影響全身其他器官。而且，無需全身用藥，一方面可減少藥物的用量及其相應(yīng)的不良反應(yīng)，降低治療成本;另一方面可將藥物直接運輸至靶器官，使其療效更加直接、顯著。目前，DMAE均為外用產(chǎn)品，已經(jīng)具有穩(wěn)定可靠的療效，如果結(jié)合Mesotherapy的獨特優(yōu)勢，將會具有更加直接、有效的抗衰老療效，但其深入的作用機制還有待于更深層次的研究。

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EffectofdimethylaminoethanoandcompoundaminoacidonMMP-1andTIMP-1mRNAexpressionofratagingskin

LIUSu,FANYa-hong,ZHAOCai-ling,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510280,China)

ObjectiveTo study the effect of dimethylaminoethano and compound amino acid on MMP-1 and TIMP-1 mRNA expression of rat aging skin induced by D-galactose.MethodsEighty wistar rats were randomly divided into the normal control group, the aging control group and the experimental groups. At 18 days after D-gal induction, the experimental groups were treated with intradermal microinjection of 0.2%DMAE+AA、0.1%DMAE+AA、0.2%DMAE、0.1%DMAE、AA and normal saline (NS) on bilateral buttocks respectively, once a week for 4 weeks. At 42 days after treatment, the histological changes, the dermal thickness, hydroxyproline (Hyp) and mRNA expression of MMP-1， TIMP-1 and PCNA in every group were detected.ResultsMesotherapy with intradermal co-injection of 0.1%DMAE+AA, or 0.2%DMAE+AA significantly increased the dermal thickness, Hydroxyproline content and MMP-1 mRNA expression levels, but did not affect the expression of TIMP-1 mRNA and PCNA in aging rats.ConclusionLocal co-injection of DMAE and compound AA directly into target tissue under mesotherapy has marked anti-aging effects on D-galactose induced skin aging model of rat by degradation of aging collagen fiber and reconstruction of skin structure.

Dimethylaminoethanol; Compound Amino acid; MMP-1; TIMP-1; Mesotherapy

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.06.022

R965

A

1673-7040(2014)06-0381-04

2014-03-31)

510280 廣東 廣州，南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院 整形外科(劉 肅，柳大烈)；張家口市第二醫(yī)院 檢驗科(樊亞紅)；青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院 整形美容科(劉 肅，趙彩玲，陳振雨)

劉 肅(1970-)，女，遼寧沈陽人，副教授，碩士.

柳大烈，510280，南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院 整形外科，電子信箱：liudalie@hotmail.com