彭 梅，唐健波，肖 雄，楊 娟

(貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 55002)

仙茅為仙茅屬植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根狀莖。具溫腎陽、壯筋骨、治陽痿精冷等功效［1］，有很好調(diào)節(jié)免疫功能的作用［2］。本課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)仙茅中富含多糖，且仙茅多糖有良好的抗腫瘤功效［3］，有很好的開發(fā)利用前景。目前，有關(guān)仙茅多糖的研究較少，提取工藝對其提取率及抗腫瘤活性的影響未見文獻報道。本實驗利用均勻設(shè)計方法，該方法具有試驗點分布均勻［4-5］，特別適合多因素、多水平的實驗，其實驗次數(shù)比正交設(shè)計明顯減少［6-7］，對熱水浸提和超聲波輔助提取仙茅多糖工藝參數(shù)進行優(yōu)化，比較兩種提取方法對仙茅多糖提取率的影響;同時比較最佳工藝條件下提取的仙茅多糖抗腫瘤活性，旨在為仙茅多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與試藥

1.1 儀器 JA-2003精密電子天平 (上海恒平科技有限公司);R220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (瑞士Buchi公司);HP-8453紫外可見分光光度計 (美國HP公司);SB25-12DTD型超聲波 (寧波新芝生物科技有限公司)，恒溫水浴鍋。

1.2 材料與試藥 仙茅藥材于2012年9月購自貴陽市萬東橋藥材市場，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文副教授鑒定為仙茅Curculigo Orchioides Gaertn的根。S180腹水瘤為貴州大學(xué)楊再昌教授惠贈，環(huán)磷酰胺粉針劑 (江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，羧甲基纖維素鈉 (鄭州順達化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗方法與設(shè)計

2.1.1 原料預(yù)處理 將新鮮仙茅根塊切碎曬干，適當粉碎后用75%～80%的乙醇回流提取6次，以除去脂溶性成分及單糖、低聚糖，乙醇提取后的殘渣經(jīng)風(fēng)干后得脫脂的仙茅根干粉，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 熱水浸提工藝設(shè)計 稱取脫脂處理的仙茅干粉5 g，加入蒸餾水后水浴加熱提取一定時間。提取液抽濾，收集濾液，殘渣按上述方法重復(fù)提取2次。濾液合并，減壓濃縮至一定體積后，加入食用酒精沉淀 (酒精最終體積分數(shù)不低于80%)。抽濾，沉淀物分別用90%酒精和丙酮洗滌，真空干燥后即為粗多糖。

選取提取時間、提取溫度、液料比為多糖提取率的影響因素，按(5×5×5)均勻設(shè)計表安排實驗 (表1)。

表1 熱水浸提試驗因素水平

2.1.3 超聲波輔助提取工藝 稱取脫脂處理的仙茅干粉5 g，加入蒸餾水后置于超聲波中提取。提取液抽濾，收集濾液，殘渣按上述方法再重復(fù)提取1次。合并濾液，減壓濃縮至一定體積后，加入食用酒精沉淀 (酒精最終體積分數(shù)不低于80%)。抽濾，沉淀物分別用90%酒精和丙酮洗滌，真空干燥后即為粗多糖。

實驗選取時間、提取溫度、液料比、超聲波功率為多糖提取率的影響因素，按(6×6×6×6)均勻設(shè)計表安排實驗，見表2。

表2 超聲波提取試驗因素水平

2.1.4 多糖提取率計算 用葡萄糖做標準曲線，硫酸-苯酚法測定多糖的量［8］計算仙茅多糖提取率。

2.1.5 多糖抗腫瘤試驗 將熱水浸提法和超聲波輔助提取法最佳工藝條件下制備的仙茅多糖進行抗腫瘤活性試驗。將96只昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，每只小鼠接種0.2 mL S180腹水液于右腋下，按體質(zhì)量隨機分為8個組，每組12只，雌雄各半。分別為空白組、超聲波提取仙茅多糖低(100 mg/kg)、中 (200 mg/kg)、高 (400 mg/kg)劑量組;熱水浸提仙茅多糖低 (100 mg/kg)、中 (200 mg/kg)、高(400 mg/kg)劑量組及陽性對照環(huán)磷酰胺組 (100 mg/kg)。仙茅多糖用0.5%的CMC-Na配制成上述給藥劑量，按體質(zhì)量 (0.1 mL/10 g)每天灌胃給予小鼠多糖 (灌胃前小鼠空腹1 h，不禁水);空白組及陽性對照組給予等體積生理鹽水，陽性對照組采用一次最大劑量法，即在接種腫瘤后次日每只小鼠注射0.1 mL環(huán)磷酰胺 (100 mg/kg)后不再給藥［9］。給藥期間小鼠自由飲水、進食，自然光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度 (18±2)℃，濕度為 (50±5)%。小鼠連續(xù)給藥10 d后處死，取出胸腺、脾臟及腫瘤，并以胸腺、脾臟指數(shù)及抑瘤率為指標，考察多糖的抗腫瘤活性。

2.1.6 數(shù)據(jù)處理 采用DPS v7.50版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對提取工藝結(jié)果進行二次多項式回歸分析;SPSS 17.0對抗腫瘤試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2.2 實驗結(jié)果

表3 均勻設(shè)計法熱水浸提仙茅多糖試驗的安排及結(jié)果

表4 均勻設(shè)計法超聲波提取仙茅多糖試驗安排及結(jié)果

2.2.3 兩種提取方法制備的多糖對S180實體瘤小鼠的抗腫瘤作用 將兩種提取方法最佳工藝條件下制備的仙茅多糖進行抗腫瘤活性比較。以空白組為陰性對照，環(huán)磷酰胺為陽性對照，以小鼠抑瘤率為考察指標，結(jié)果如表5所示。當抑瘤率達到40%以上，說明藥物具有一定的抗腫瘤作用［10］，從表5中可以看出，兩種提取方法制備的多糖給藥組，除超聲波提取的高劑量組外，其余各組抑瘤率均大于40%，具有抗腫瘤作用。超聲波提取的仙茅多糖隨劑量的增加，抑瘤率反而下降;熱水浸提的仙茅多糖隨劑量的增加抑瘤率增加，且高劑量組達到64.50%，具有較好的抗腫瘤作用。除超聲波提取低劑量組外，在同等劑量下，熱水浸提的仙茅多糖的抑瘤率顯著優(yōu)于超聲波提取的抑瘤率。

表5 兩種方法提取的多糖抗腫瘤作用 (，n=12)

表5 兩種方法提取的多糖抗腫瘤作用 (，n=12)

組 別 劑量/(mg·kg－1) 抑瘤率/%空白組 － －陽性對照組 100 86.54超聲提取低劑量 100 51.11超聲提取中劑量 200 42.21超聲提取高劑量 400 31.43熱水浸提低劑量 100 42.79熱水浸提中劑量 200 51.83熱水浸提高劑量400 64.50

3 小結(jié)與討論

本實驗利用均勻設(shè)計通過提高試驗點“均勻分散”的程度，使試驗點具有更好的代表性及能用較少的試驗獲得較多信息的優(yōu)點［11］，分別對熱水浸提法和超聲波輔助提取法提取仙茅多糖的工藝條件進行優(yōu)化，比較兩種方法對多糖提取率和抗腫瘤活性的影響。結(jié)果顯示，熱水浸提提取時間長、消耗能量較多，但熱水浸提具有提取溫和，不易破壞多糖的結(jié)構(gòu)特點;超聲波作為一種新型的提取手段，應(yīng)用機械效應(yīng)、熱學(xué)效應(yīng)、湍流效應(yīng)等能提高提取率、省時省能量，但有報道超聲波輔助提取會使多糖的結(jié)構(gòu)被破壞［12-13］。同時超聲波具有較強的機械剪切作用，長時間作用也會使雜質(zhì)溶出［14］。本實驗中超聲波輔助提取的仙茅多糖抗腫瘤活性隨著劑量增加，抑瘤率反而降低，推測可能是因為超聲波破壞了仙茅多糖的結(jié)構(gòu)，使抗腫瘤活性下降，其具體的機制有待進一步研究。

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