• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物抗腫瘤作用及急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

      2014-11-04 15:10:08吳建軍張延英張書(shū)楠李金娟慕婷婷裴凌云
      中成藥 2014年9期
      關(guān)鍵詞:酪蛋白多肽灌胃

      吳建軍,張延英,張書(shū)楠,李金娟,慕婷婷,裴凌云,趙 翊

      (甘肅中醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

      酪蛋白 (casein)是牛奶中的主要組成成分,它是一組蛋白的磷酸鹽,由4種成分組成:αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白[1]。貞芪酪蛋白肽 (ligustri-astragali casein co-peptid,LACP)是根據(jù)“扶正培本、扶正祛邪”的理論,將黃芪、女貞子按一定比例通過(guò)水提醇沉法干燥以后再與酪蛋白復(fù)合肽按一定比例混合而成[2]。為探討其對(duì)實(shí)體瘤生長(zhǎng)抑制作用及機(jī)制和安全性,進(jìn)行了本次研究。

      1 實(shí)驗(yàn)材料

      1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 將Lewis肺癌細(xì)胞置于含10%胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 d更換1次培養(yǎng)液,0.25%胰蛋白酶消化傳代。調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液備用。Lewis肺癌細(xì)胞由蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所提供。

      1.2 荷瘤小鼠模型的制作及毒性試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡C57小鼠72只,雌性,體質(zhì)量18~22 g,由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供 (實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001)。選用培養(yǎng)的Lewis肺癌細(xì)胞按106個(gè)/mL制成細(xì)胞懸液,在各組小鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2 mL懸液。急性毒性試驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)小鼠由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供,昆明種小鼠100只,雌雄各半,體質(zhì)量18~22 g,實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水喂養(yǎng)12 h,室溫18~22℃,相對(duì)濕度50%~70%。

      1.3 藥品及試劑 貞芪酪蛋白為以黃芪、女貞子按一定比例按水提醇沉法干燥以后再與酪蛋白復(fù)合肽按一定比例混合而成,酪蛋白由蘭州同健生物醫(yī)藥公司提供,批號(hào)090211。小牛血清購(gòu)于杭州四季青公司,RPMI-1640培養(yǎng)基干粉為Gibco公司產(chǎn)品,胰蛋白酶由美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品,Iα抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,其他試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純。

      2 實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 LACP復(fù)合物體內(nèi)抗腫瘤研究的分組及處理 將72只小鼠除隨機(jī)抽取12只作為陰性對(duì)照組之外,其余小鼠Lewis細(xì)胞接種后24 h隨機(jī)分為5組,分別為模型組,貞芪酪蛋白肽復(fù)合物1.5、2.1、3.5 g/kg 3個(gè)劑量組,陽(yáng)性藥物采用金復(fù)康口服液 (江中集團(tuán)一村制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn),批號(hào)101208);每日2次,連續(xù)灌胃給藥后第11天麻醉小鼠脫頸處死。生理鹽水進(jìn)行腹腔灌洗,輕柔腹腔2 min后,解剖小鼠抽取灌洗液稀釋細(xì)胞,單核細(xì)胞分離液分離的單核細(xì)胞,調(diào)整密度至106個(gè)/mL,以FITC標(biāo)記的Iα單抗 (Sigma公司)標(biāo)記細(xì)胞,洗滌后流式細(xì)胞儀檢測(cè)單核細(xì)胞Iα分子表達(dá)活性 (以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例表示)。另外,取不同劑量組給藥的小鼠右腋窩皮下新鮮腫瘤組織制備單細(xì)胞懸液于試管中。靜止10 min,吸取上層混濁液。上層混濁液2000 r/min離心5 min,倒去上清。PBS洗滌,制成單細(xì)胞懸液,PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

      2.2 急性毒性及最大耐受量的測(cè)定

      2.2.1 LACP復(fù)合物L(fēng)D50測(cè)定 取SPF級(jí)昆明種小鼠60只,雌雄各半,按隨機(jī)數(shù)字表分為4組 (空白組和不同給藥劑量的受試藥物組),每組15只。給藥劑量為2.0、1.0和0.5 g/kg。按0.20 mL/10 g分別對(duì)各受試藥物組小鼠進(jìn)行灌胃給藥,空白組灌胃給予等體積的生理鹽水。24 h內(nèi)給藥3次,觀察記錄小鼠毛色、自主活動(dòng)、呼吸、飲食、大小便等一般情況、中毒表現(xiàn)及死亡情況,共14 d。

      2.2.2 LACP復(fù)合物最大耐受量 (MTD)的測(cè)定 取SPF級(jí)昆明種小鼠40只,雌雄各半,隨機(jī)分為2組 (空白組和受試藥物組),每組20只。受試藥物最大質(zhì)量濃度200 mg/mL貞芪酪蛋白按0.4 mL/10 g灌胃給藥,空白組灌胃給予等體積的生理鹽水。

      3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      3.1 LACP復(fù)合物對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞周期的影響 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物作用肺癌實(shí)體瘤細(xì)胞,高、中劑量組可見(jiàn)G1期細(xì)胞明顯增多,分別達(dá)到78.1%和64.4%,G2期細(xì)胞減少為4.77%和0.439%,S期分別為17.1%和35.1%,提示細(xì)胞發(fā)生明顯的G1/G2期阻滯。見(jiàn)圖1。

      圖1 芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞周期的影響

      3.2 LACP復(fù)合物對(duì)免疫細(xì)胞Mφ表面Iα抗原表達(dá)的影響

      貞芪酪蛋白肽復(fù)合物能夠促進(jìn)小鼠Mφ細(xì)胞系統(tǒng)類(lèi)Iα抗原表達(dá),顯示貞芪酪蛋白肽復(fù)合物可以提高小鼠免疫功能,見(jiàn)表1。

      表1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)小鼠Mφ表面Iα抗原表達(dá)陽(yáng)性率的影響 (,n=10)

      表1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)小鼠Mφ表面Iα抗原表達(dá)陽(yáng)性率的影響 (,n=10)

      注:與模型組比較,▲P<005,▲▲P<001

      組別 劑量/(g·kg -1)Iα抗原表達(dá)的陽(yáng)性率/%36.7±4.1模型組 生理鹽水 37.2±3.9金??悼诜航M 0.1 mL/g 49.9±3.9▲貞芪酪蛋白復(fù)合肽低劑量組 1.5 39.1±3.6貞芪酪蛋白復(fù)合肽中劑量組 2.1 50.3±4.2▲貞芪酪蛋白復(fù)合肽高劑量組 3.5 56.0±4.5陰性對(duì)照組 生理鹽水▲

      3.3 LACP復(fù)合物L(fēng)D50測(cè)定結(jié)果 給藥后連續(xù)觀察7 d,記錄動(dòng)物死亡、體質(zhì)量變化和毒性反應(yīng)情況,結(jié)果無(wú)一只動(dòng)物死亡,因受試藥物濃度和體積限制,無(wú)法測(cè)出受試藥物的LD50(見(jiàn)表2),故進(jìn)行MTD測(cè)定。

      表2 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 (n=15)

      3.4 LACP復(fù)合物MTD測(cè)定結(jié)果 給藥后連續(xù)觀察10 d,初步測(cè)得MTD值為8 g/kg,記錄小鼠中毒癥狀和死亡情況。觀察結(jié)果為小鼠活動(dòng)自如,皮毛整潔、有光澤,鼻、眼、口腔未見(jiàn)異常分泌物,進(jìn)食、排泄物及呼吸狀況等均正常,受試動(dòng)物無(wú)一只死亡。第10天處死全部小鼠,解剖并觀察各鼠主要臟器 (心、肝、脾、肺、腎),未見(jiàn)任何異常改變。小鼠體質(zhì)量變化觀察結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,受試藥物組小鼠體質(zhì)量增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

      表3 MTD測(cè)定在觀察期限內(nèi)體質(zhì)量的變化 (,n=20)

      表3 MTD測(cè)定在觀察期限內(nèi)體質(zhì)量的變化 (,n=20)

      注:所有組不同時(shí)間與空白組比較,P>0.05

      給藥后體質(zhì)量1 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d 9 d 10 d空白組 0.4mL/10g 19.2±1.919.8±2.118.5±1.720.1±2.221.5±2.623.2±2.623.8±2.524.8±3.125.6±組別 劑量 開(kāi)始體質(zhì)量2.7 28.2±3.2受試組 100 mg/mL 19.8±1.720.5±1.919.2±1.921.4±2.122.5±2.623.9±2.624.1±2.725.6±2.928.2±3.2 29.0±3.9

      4 討論

      貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)作用在前期的研究中已經(jīng)作了論述,其灌胃給藥可有效抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng),其抗腫瘤作用機(jī)制可能與改善荷瘤鼠免疫功能等有關(guān)[3]。多數(shù)蛋白質(zhì)都存在具有生物活性的多肽序列,酶解蛋白質(zhì)可以釋放生物活性多肽[4]。牛乳中酪蛋白中蘊(yùn)藏著許多生物活性肽,包括阿片活性肽、抗高血壓肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗血栓肽、結(jié)合礦物元素的活性肽、抗菌肽等[5-8]。隨著活性肽的研究深入和酶工程技術(shù)應(yīng)用,促進(jìn)了人們對(duì)活性肽物質(zhì)的興趣,推進(jìn)了多肽產(chǎn)品如肽類(lèi)藥物、肽類(lèi)試劑、化妝品等開(kāi)發(fā)研究[9-12]。目前,日本以及歐美等國(guó)家已上市的大量的活性肽功能性食品或食品添加劑,主要用于調(diào)節(jié)免疫,促進(jìn)康復(fù),預(yù)防疾病發(fā)生等。酪蛋白復(fù)合多肽同傳統(tǒng)中藥嫁接將極大地豐富完善各自藥理作用,前期課題組的研究進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論[3,13-15],本研究根據(jù)“扶正培本、祛邪”理論將黃芪、女貞子與酪蛋白按一定比例配制而成并探索了其抗腫瘤作用及機(jī)制。非已抗原 (如細(xì)菌等)以非特異性方式與巨噬細(xì)胞結(jié)合,后者借助吞噬、胞飲、吸附或FcR、CR介導(dǎo)的調(diào)理作用攝取抗原。巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能與細(xì)胞表面的細(xì)胞因子Iα等表達(dá)密切相關(guān),所以巨噬細(xì)胞表面Iα的表達(dá)被認(rèn)為是代表機(jī)體免疫功能的重要標(biāo)志之一。本研究應(yīng)用FITC標(biāo)記的Iα單抗借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示LACP能提高巨噬細(xì)胞表面Iα抗原表達(dá),可能進(jìn)一步揭示LACP抗腫瘤與調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫功能有關(guān)。大多數(shù)抗腫瘤藥物主要作用之一與抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān),阻滯腫瘤細(xì)胞從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,本研究顯示LACP阻滯腫瘤細(xì)胞于G1/G2期。

      本實(shí)驗(yàn)未測(cè)出貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物的LD50表明貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物的毒性極低;小鼠灌胃給藥的MTD為8g/kg(相當(dāng)于臨床成人擬用藥量300倍),在該劑量下未見(jiàn)小鼠發(fā)生任何毒性反應(yīng),處死小鼠解剖后觀察其主要臟器未見(jiàn)任何異常,顯示了LACP復(fù)合物的低毒和安全性,為L(zhǎng)ACP保健品開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

      [1]楊永新,王加啟,卜登攀,等.牛乳重要營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)特征的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2013,34(1):328-331.

      [2]張延英,吳建軍,王鵬善,等.貞芪酪蛋白肽復(fù)合物血清對(duì)人肺腺癌A549"細(xì)胞分化抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(4):114-117.

      [3]吳建軍,金 玉,張延英,等.貞芪酪蛋白肽復(fù)合物對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠抗瘤作用及對(duì)IL-2、TNF的影響[J].中成藥,2012,34(12):2051-2054.

      [4]李 勇.生物活性肽研究現(xiàn)況和進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(1):3-8.

      [5]宮 霞,郭本恒,李云飛,等.酶解酪蛋白生產(chǎn)生物活性肽的研究現(xiàn)狀及開(kāi)發(fā)前景[J].中國(guó)乳品工業(yè),2005,33(4):44-47.

      [6]Pinto G,Caira S,Cuollo M,et al.Lactosylated casein phosphopeptides as specific indicators of heated milks[J].Anal Bioanal Chem,2012,402(5):1961-72.

      [7]Petersen B L,Ward L S,Bastian E D,et al.A whey protein supplement decreases post-prandial glycemia[J].Nutr J,2009,16(8):47.

      [8]王 磊,成 雪,毛學(xué)英.乳清蛋白及其活性多肽的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2010,12(5):30-35.

      [9]宋益民,高本波,高 爾,等.蝎毒活性多肽對(duì)兔和大鼠的血小板聚集、大鼠血漿中TXB2,PGF1α及血栓形成的影響[J].中成藥,2002,24(10):782-784.

      [10]周永治.生物活性肽的種類(lèi)及應(yīng)用[J].江蘇調(diào)味副食品,2007,24(6):11-13.

      [11]楊 闖.生物活性肽在營(yíng)養(yǎng)保健中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2003,24(11):153-154.

      [12]藍(lán)文濱.動(dòng)物蛋白生物活性肽的研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2004,25(5):66-69.

      [13]張延英,朱建坤,吳建軍,等.貞芪酪蛋白肽藥物血清誘導(dǎo)A549細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2008,14(9):47-49.

      [14]汪永鋒,張延英,李廣遠(yuǎn),等.貞芪酪蛋白復(fù)合肽對(duì)人鼠巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用[J].中醫(yī)研究,2007,19(3):22-24.

      [15]汪永鋒,張延英,李廣遠(yuǎn),等.貞芪酪蛋白復(fù)合肽對(duì)免疫低下小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2006,24(8):135-136.

      猜你喜歡
      酪蛋白多肽灌胃
      蛋氨酸對(duì)奶牛乳腺酪蛋白合成及其上皮細(xì)胞自噬的影響
      高多肽含量苦瓜新品種“多肽3號(hào)”的選育
      小鼠、大鼠灌胃注意事項(xiàng)
      抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
      酪蛋白磷酸肽-鈣絡(luò)合物對(duì)酸乳貯藏特性的影響
      來(lái)曲唑灌胃后EM大鼠病灶體積及COX-2 mRNA、survivin蛋白表達(dá)變化
      胎盤(pán)多肽超劑量應(yīng)用致嚴(yán)重不良事件1例
      徐寒梅:創(chuàng)新多肽藥物研究與開(kāi)發(fā)
      實(shí)驗(yàn)小鼠的灌胃給藥技巧
      酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的研究進(jìn)展
      浑源县| 如东县| 左云县| 杨浦区| 南木林县| 新安县| 夏邑县| 泗洪县| 普定县| 同德县| 门头沟区| 福建省| 习水县| 南开区| 天镇县| 股票| 乐昌市| 乐清市| 甘孜县| 右玉县| 遂溪县| 金门县| 林甸县| 东山县| 教育| 夹江县| 昂仁县| 馆陶县| 万山特区| 收藏| 平江县| 永昌县| 建德市| 徐水县| 西昌市| 庆云县| 樟树市| 盐津县| 阿克陶县| 靖远县| 玉环县|