葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元延遲整流鉀電流的作用

田華++劉富++劉冰華++高音++曲麗輝

摘 要：目的：旨在觀察葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制的探討。方法：通過(guò)采用改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈持久性結(jié)扎法制作血管性癡呆模型，并利用全細(xì)胞式膜片鉗技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)，觀察葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元延遲整流鉀電流的影響。結(jié)果：（1）與正常組相比，血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元Ik電流強(qiáng)度下降，下降幅度為14.79%±5.6%（P<0.05）。（2）與模型組相比，葛根素組的Ik電流幅度呈現(xiàn)顯著下降抑制率為（34.48±8.3）%（n=5，P﹤0.01）。（3）Western blot結(jié)果顯示，模型組KV 2.1表達(dá)低于正常組（P<0.05）；與正常組和模型組相比，葛根素組KV 2.1的表達(dá)量均明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：葛根素可能通過(guò)抑制延遲整流鉀電流對(duì)血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：葛根素 頂葉皮層 全細(xì)胞式膜片鉗技術(shù) 延遲整流鉀電流

中圖分類號(hào)：G64 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2014）04（b）-0250-02

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是繼阿爾茨海默病之后第二位最常見(jiàn)的癡呆癥，在我國(guó)老年人中尤為常見(jiàn)和多發(fā)。血管性癡呆實(shí)際上是指大腦功能衰退，特別是與智能有關(guān)的功能全面衰退。造成腦血管性癡呆的主要原因是腦血流量減少， 引起腦組織生化代謝障礙[1-2]。

葛根素（Puerarin，Pur）從葛根中提取出的有效成分，化學(xué)名為4，7—一二羥基-8-D葡萄糖基異黃酮，近年對(duì)葛根的研究較為深入，目前葛根素被廣泛用于心腦血管疾病等急性期的治療，包括心絞痛、心肌梗塞，心律失常、腦缺血等[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能明顯降低腦梗死患者的梗死灶面積，降低急性腦梗死患者的血流變和提高神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分[4]。各種離子通道的結(jié)構(gòu)和功能異常與心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道，葛根素可不同程度的影響心肌鈉、鉀、鈣離子通道[5-6]。然而對(duì)于葛根素的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的研究方法主要集中在利用酶學(xué)、形態(tài)學(xué)及免疫組化等方面，利用膜片鉗技術(shù)考察葛根素其神經(jīng)保護(hù)作用的研究較少，唐瑜等利用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，葛根素可以抑制腦缺血再灌注損傷的大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞L-型鈣通道[7]，但是葛根素對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元鉀離子通道的作用如何目前仍未見(jiàn)報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)擬采用全細(xì)胞式膜片鉗技術(shù)觀察葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠頂葉皮層神經(jīng)元延遲整流鉀電流（IK）的調(diào)制作用，從離子通道角度為進(jìn)一步揭示葛根素防治缺血性腦損傷的可能機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

（1）建立動(dòng)物模型及分組成年昆明小鼠，18～22 g，雌雄不限，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究中心提供。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈持久性結(jié)扎法，并對(duì)該方法進(jìn)行改良制作血管性癡呆模型，采用跳臺(tái)試驗(yàn)鑒別血管性癡呆動(dòng)物模型是否成功建立。模型建立后小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和葛根素組，各組立即給予相應(yīng)藥物。正常組和模型組：腹腔注射生理鹽水，1次/日，注射14天。葛根素組：腹腔注射葛根素注射液（1 mg/mL），1.0 mL/100 g，1次/日，注射14 d。

（2）試劑與儀器 Protease、EGTA 、HEPES均為Sigma公司產(chǎn)品，葛根素注射液（安徽聯(lián)誼藥業(yè)股份有限公司）；β-actin、Kv2.1抗體及其相應(yīng)二抗購(gòu)自santa cluz公司，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。IBBMClamp32數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)以及PC-IIC型膜片鉗放大器均由華中理工大學(xué)研制。

（3）神經(jīng)元急性分離與全細(xì)胞記錄。將小鼠急性斷頭取腦，取頂葉皮質(zhì)，并置于人工腦脊液（ASF）（0～4 ℃）中，將其切成冠狀腦片（厚度約400～500 μm），在預(yù)先通好（95% O2+5% CO2）混合氣的ASF（37℃）中孵育30min，之后在含0.5%protease的ASF（37℃）中消化30-35 min，連續(xù)通混合氣并微震蕩腦片。消化結(jié)束后，取2片腦片用0～4℃ASF沖洗3次，用剪刀將組織剪碎成1mm3的組織塊，用尖端拋光的Pasteur吸管吹打并吹散組織塊，靜置3～5 min后，吸取上清液滴于預(yù)先備好的細(xì)胞外液培養(yǎng)皿中，靜置待細(xì)胞貼壁，選取狀態(tài)良好的神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞式膜片鉗實(shí)驗(yàn)，首先使電極貼近細(xì)胞并形成高阻封接（>1 G?），負(fù)壓吸引形成全細(xì)胞式，在電壓鉗模式下，將保持電壓（HP）置于-80 MV，首先給予﹣40MV的預(yù)刺激，波寬150 ms，隨后給予去極化脈沖刺激（﹣40 MV—+60 MV），階躍電壓10MV，刺激波寬150 ms，以300 ms處的電流值計(jì)算IK并觀察其變化。

（4）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IK以300 ms處的電流值統(tǒng)計(jì)計(jì)算，抑制率計(jì)算公式為：（1-IK實(shí)驗(yàn)組/IK對(duì)照組）×100%。結(jié)果分析采用SPSS軟件，結(jié)果用（x±SD）表示，t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 葛根素注射液對(duì)血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元Ik的抑制作用

急性分離各組小鼠皮層神經(jīng)元，取狀態(tài)良好的神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。形成全細(xì)胞封接后，以300 ms處的電流值計(jì)算IK。記錄的外向電流可被四氨基吡啶（4-AP）（2 μmol/L）和四乙胺（TEA）（10 μmol/L）所抑制，用CSCl替換電極內(nèi)液KCl則不能激活出此外向電流，證實(shí)該電流為延遲整流鉀電流并記錄。以在指令電壓+60 mV時(shí)電流值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，與正常組相比，血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元Ik電流幅度有所下降，下降幅度為（14.79±5.6）%（P<0.05）；與模型組相比，葛根素組的Ik電流幅度呈現(xiàn)顯著下降，抑制率為（34.48±8.3）%（n=5，P﹤0.01）。

2.2 葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠皮層Kv2.1蛋白表達(dá)量的影響

急性分離的各組小鼠頂葉皮層腦組織，用細(xì)胞裂解液處理，細(xì)胞蛋白溶出，進(jìn)行蛋白定量，采用Western blot方法，用抗體檢測(cè)細(xì)胞KV 2.1含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組、模型組、葛根素組均可見(jiàn)有KV 2.1表達(dá)條帶；定量分析顯示，模型組KV 2.1表達(dá)低于正常組（P<0.05）；與正常組和模型組比較，而葛根素組KV 2.1的表達(dá)量均明顯降低（P<0.01，P<0.05）。endprint

3 討論

腦血管性癡呆與離子通道結(jié)構(gòu)和功能異常之間有著密切的關(guān)系，鉀通道是分布最廣、類型最多的一類離子通道，具有種類多、亞型多、性質(zhì)復(fù)雜等的特點(diǎn)，幾乎存在于所有的細(xì)胞膜上并發(fā)揮著多種生物功能。本實(shí)驗(yàn)中，在電壓為-40 mV時(shí)瞬時(shí)外向鉀電流已經(jīng)失活，激活的外向電流可以被4-AP和TEA所抑制，此外，若電極內(nèi)液KCl被CsCl替代后則不能激活出此外向電流，因此可證實(shí)此外向電流是電壓門(mén)控性延遲整流鉀電流。

以往研究主要通過(guò)考察葛根素對(duì)大、小鼠各腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)、酶類或者神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響試圖揭示葛根素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用及機(jī)制，如葛根素對(duì)缺氧缺糖、谷氨酸鈉引起的體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[8]，能減少突觸體鈣超載和神經(jīng)元陽(yáng)性凋亡細(xì)胞出現(xiàn)率， 提示葛根素的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用與抑制突觸體鈣超載有關(guān)[9]。但從離子通道角度探討葛根素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，尤其是葛根素對(duì)血管性癡呆動(dòng)物模型離子通道的影響報(bào)道較少。

研究表明，腦缺血所致的腦組織損傷可使神經(jīng)元細(xì)胞膜鉀通道失活，細(xì)胞膜去極化，導(dǎo)致細(xì)胞興奮性升高， 致使膜電位不易恢復(fù)。IK電流是由延遲整流鉀通道介導(dǎo)的鉀離子外流產(chǎn)生的，能延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，還可參與皮層神經(jīng)元的調(diào)亡過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆小鼠腹腔注射葛根素注射液14天后，絕大多數(shù)小鼠的頂葉皮層神經(jīng)元的IK明顯降低，同時(shí)分子生物學(xué)結(jié)果顯示，葛根素可降低血管性癡呆小鼠頂葉皮層腦區(qū)Kv2.1蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示葛根素血管性癡呆小鼠頂葉皮層神經(jīng)元IK有抑制作用，可能會(huì)影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，參與機(jī)體免疫與炎癥反應(yīng)過(guò)程，調(diào)節(jié)機(jī)體在生理或病理?xiàng)l件下的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元退行性變過(guò)程中，鉀通道阻斷劑TEA通過(guò)阻斷IK電流發(fā)揮保護(hù)易感細(xì)胞亞群的作用。那么，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠皮層延遲整流鉀電流也存在一定的抑制作用，提示，葛根素可能在神經(jīng)元退行性變過(guò)程中也可能發(fā)揮一定的保護(hù)易感細(xì)胞亞群的作用，但具體機(jī)制如何尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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