蒲小琴 ，曾 巧 ，徐 溢

(1．重慶科技學(xué)院，重慶 401331;2．重慶大學(xué)，重慶 400030;3．重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司，重慶 400061)

鹽酸瑞伐拉贊(revaprazan hydrochloride)為新一代可逆質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，也是全球唯一上市的鉀競爭性酸泵抑制劑或酸泵拮抗劑，主要用于治療十二指腸潰瘍和胃炎、急性胃炎、慢性胃炎以及胃癌病灶的改善和短期治療消化性潰瘍。與傳統(tǒng)PPI不同的是，其通過競爭性抑制質(zhì)子泵(即H+，K+－ATP酶)中的K+而起作用，是一種可逆的鉀拮抗劑。由于鹽酸瑞伐拉贊抑酸效果和質(zhì)子泵活化情況無關(guān)，臨床可明顯減少夜間酸突破的發(fā)生。同時(shí)，由于其具有親脂性、弱堿性、解離常數(shù)高和在低pH時(shí)穩(wěn)定的特點(diǎn)，故在酸性環(huán)境下立刻離子化，通過離子型結(jié)合抑制H+，K+－ATP酶，不需要集中于胃壁細(xì)胞的微囊和微管及酸的激活，能迅速升高胃內(nèi)pH，而在離解后酶活性能得到有效的恢復(fù)，在治療劑量時(shí)對其他酶影響很小，對機(jī)體生理功能的影響也非常小。鹽酸瑞伐拉贊對胃消化性潰瘍具有良好的治療作用和較少的不良反應(yīng)，在消化性潰瘍領(lǐng)域的潛力及市場需求將非常巨大[2－4]。通過文獻(xiàn)及專利檢索發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外的文獻(xiàn)及專利資料中，僅有1篇報(bào)道采用高效液相色譜(HPLC)法測定其體外溶出度[5]，1篇報(bào)道采用液－質(zhì)聯(lián)用(LC－MS)方法測定其血漿藥物濃度[6]，未見有雜質(zhì)控制方面的報(bào)道。鹽酸瑞伐拉贊中可能含有3種雜質(zhì)(雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C)，有關(guān)物質(zhì)是影響產(chǎn)品質(zhì)量及安全性最重要的指標(biāo)，故建立一種能有效控制產(chǎn)品中有關(guān)物質(zhì)含量的檢測方法勢在必行。本研究中針對此新型化合物開發(fā)有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)控方法，以高效液相色譜系統(tǒng)為測試體系，建立了以磷酸氫二鈉－乙腈為分離體系、高靈敏度的有關(guān)物質(zhì)測定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Dionex U3000型高效液相色譜儀(多波長紫外檢測器)，Chromeleon色譜工作站(Dionex公司);Agilent 8453型紫外－可見分光光度計(jì);電子天平(Mettler Toledo公司);PB－10精密pH計(jì)(德國賽多利斯公司)。鹽酸瑞伐拉贊(批號為 RF2014001，RF2014002，RF2014003)，雜質(zhì) A(1 － 甲基 －1，2，3，4 － 四氫異喹啉，批號為 YKL－201402001)，雜質(zhì) B[4－羥基 －2－(4－氟苯胺)－5，6－二甲基嘧啶，批號為 QJ－201402001]，雜質(zhì) C[4－氯 －2－(4－氟苯胺)－5，6－二甲基嘧啶，批號為 LD－201402001]均由重慶福美達(dá)科技有限公司提供，結(jié)構(gòu)式見圖1[7－9];磷酸氫二鈉、磷酸為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

圖1 鹽酸瑞伐拉贊及其雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:Inertsil－ C8柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0．01 mol/L磷酸氫二鈉溶液(用磷酸調(diào)pH為4．0)－乙腈(30∶70);檢測波長:205 nm;流速:1．0 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)以瑞伐拉贊峰計(jì)不得低于5 000，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1．5。

2．2 溶液制備

取鹽酸瑞伐拉贊適量，加70%乙腈水溶液溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為0．6 g/L的溶液，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液0．5 mL，置100 mL容量瓶中，加70%乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對照溶液(約 3 μg/mL)。

2．3 測定法

精密量取對照溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10% ～20%。再精密量取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，同時(shí)做溶劑空白試驗(yàn)。供試品溶液中如顯雜質(zhì)峰，以峰面積按稀溶液自身對照法進(jìn)行計(jì)算。

2．4 方法學(xué)考察

2．4．1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密稱取雜質(zhì)A，B，C及鹽酸瑞伐拉贊適量，加70%乙腈水溶液溶解并稀釋制成每1 mL中約含0．6 mg鹽酸瑞伐拉贊、12 μg雜質(zhì)A，12 μg 雜質(zhì) B，12 μg質(zhì)雜 C 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。理論板數(shù)以瑞伐拉贊峰計(jì)為13 500，主峰與各雜質(zhì)峰、各雜質(zhì)間的分離度均大于 1．5(分離度 r=6．48，16．99，17．62)，見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2．4．2 專屬性試驗(yàn)

對本品分別進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、強(qiáng)氧化、強(qiáng)光照的降解試驗(yàn)(供試品溶液質(zhì)量濃度約為0．6 g/L)，考察鹽酸瑞伐拉贊與各降解產(chǎn)物的分離情況，同時(shí)也考察鹽酸瑞伐拉贊在各條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果見圖3?？梢?，各降解條件下的降解產(chǎn)物均能與鹽酸瑞伐拉贊達(dá)到基線分離，不干擾有關(guān)物質(zhì)測定，且雜質(zhì)之間也得到了較好分離，陰性無干擾。該方法專屬性強(qiáng)，適用于鹽酸瑞伐拉贊中有關(guān)物質(zhì)的測定。另外，鹽酸瑞伐拉贊對強(qiáng)堿、強(qiáng)光照、強(qiáng)氧化條件均較穩(wěn)定，強(qiáng)酸條件下略有降解，較高溫度條件下較其他條件更敏感。

2．4．3 檢測限及定量限試驗(yàn)

取鹽酸瑞伐拉贊適量，加70%乙腈水溶液溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL(相當(dāng)于供試品溶液的0．2%)的供試品溶液。精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，同時(shí)采集基線噪聲，以3倍噪聲計(jì)算檢測限，10倍噪聲計(jì)算定量限。檢測限為 0．09 μg/mL(S/N=3，相當(dāng)于供試品溶液的 0．015%)，定 量 限 為 0．30 μg/mL(S/N=10，相 當(dāng) 于 供 試 品 溶 液 的0．05%)。

2．4．4 精密度試驗(yàn)

精密量取對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算 RSD。結(jié)果的 RSD為0．81%，表明儀器精密度好。

2．4．5 線性關(guān)系考察

取本品適量，用70%乙腈水溶液稀釋配制成質(zhì)量濃度為0．3，0．6，1．2，3．0，5．0，6．0 μg/mL 的系列溶液，分別相當(dāng)于供試品溶液的 0．05% ，0．10% ，0．20% ，0．50% ，0．80% ，1．0% 。精密量取上述溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程 A=2．186 6+41．940 2 C，r=0．999 8(n=6)。結(jié)果表明，稀溶液質(zhì)量濃度在0．3～6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，符合稀溶液自身對照法的測試要求。

圖3 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

2．4．6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液，分別于 0，6，9，12，18，24 h 時(shí)精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，以峰面積歸一化法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果供試品溶液主峰面積的 RSD為1．86%，單個(gè)雜質(zhì)的RSD為8．45%，總雜質(zhì)的 RSD為8．90%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)相對穩(wěn)定。

2．4．7 重復(fù)性試驗(yàn)

取鹽酸瑞伐拉贊適量，依法制備供試品溶液與對照溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)6次。結(jié)果單個(gè)雜質(zhì)的 RSD為5．71%，總雜質(zhì)的 RSD為6．35%，表明方法重復(fù)性良好。

2．4．8 耐用性試驗(yàn)

色譜柱:取高溫降解試驗(yàn)供試品溶液，分別選用兩根不同的Inertsil－C8柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，按擬訂色譜條件進(jìn)行測試。結(jié)果在不同編號的Inertsil－C8色譜柱上理論板數(shù)及分離度無明顯變化，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1．5，表明方法對色譜柱的耐用性好。

緩沖液pH:取高溫降解試驗(yàn)供試品溶液，分別在緩沖液pH為 3．9，4．0，4．1 的條件下，按擬訂色譜條件進(jìn)行測試。結(jié)果在不同pH的緩沖液條件下理論板數(shù)及分離度無明顯變化，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1．5，表明方法對pH的耐用性好。

柱溫:取高溫降解試驗(yàn)供試品溶液，分別在柱溫為30，35，40℃條件下，按擬訂色譜條件測試。結(jié)果在不同柱溫條件下理論板數(shù)及分離度無明顯變化，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1．5，表明本方法對柱溫的耐用性好。

流動(dòng)相比例:取高溫降解試驗(yàn)供試品溶液，分別在磷酸氫二鈉－乙腈比例為35∶65，30∶70，25∶75的條件下，按擬訂色譜條件進(jìn)行測試。結(jié)果在不同的流動(dòng)相比例條件下理論板數(shù)及分離度無明顯變化，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1．5，表明方法對流動(dòng)相在一定范圍內(nèi)比例變化的耐用性好。

2．5 樣品測定

按擬訂色譜條件，對3批鹽酸瑞伐拉贊進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測定，結(jié)果表明，建立的方法可滿足實(shí)際分析的需要，見表1。3批樣品中雜質(zhì)A，B，C均未檢出，單一未知雜質(zhì)均小于0．15%，總雜質(zhì)均小于 0．3%。

表1 3批樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3 討論

檢測波長的確定:根據(jù)鹽酸瑞伐拉贊的紫外光譜圖可知，其在205，271，304 nm波長處均有特征吸收峰，故在此3個(gè)波長條件下同時(shí)對供試品溶液進(jìn)行測定。測定結(jié)果顯示，在205 nm波長條件下能更有效地檢測產(chǎn)品中各微量雜質(zhì)，特別是雜質(zhì)A。通過專屬性試驗(yàn)進(jìn)一步證明，采用205 nm波長能有效檢測各降解產(chǎn)物。因此，選擇205 nm作為鹽酸瑞伐拉贊中有關(guān)物質(zhì)的測定波長。

流動(dòng)相的確定:以磷酸鹽緩沖液(pH為2．5～7．0)進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)緩沖液pH為4．0時(shí)峰形對稱、柱效最高，且以磷酸氫二鈉為緩沖液效果最佳。以甲醇、乙腈為有機(jī)相進(jìn)行了試驗(yàn)，以乙腈為流動(dòng)相效果更好。因此，選擇磷酸氫二鈉－乙腈為流動(dòng)相可行。

進(jìn)樣量的確定:取含0．6 g/L的鹽酸瑞伐拉贊溶液，分別進(jìn)樣8，10，20 μL，供試品溶液中雜質(zhì)檢出量基本一致。且當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，檢測限達(dá)到了0．015%，靈敏度滿足測試要求，故選擇10 μL作為進(jìn)樣量。

本試驗(yàn)中建立了測定鹽酸瑞伐拉贊中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法，該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，能快速同時(shí)測定鹽酸瑞伐拉贊中3個(gè)已知雜質(zhì)及其他未知雜質(zhì)，滿足質(zhì)控的要求。其自主開發(fā)的首創(chuàng)性為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制及質(zhì)量研究奠定了基礎(chǔ)。

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