李慶山， 杜慶華， 謝健晉， 鄧家德， 余碧珍， 江雪杰， 孟凡義△

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克羅恩病(Crohn disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是除了腸道惡性腫瘤以外比較嚴(yán)重的慢性腸道疾病，近年來的研究發(fā)現(xiàn)該疾病與腸道黏膜免疫反應(yīng)失衡有關(guān)。雖然目前該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但是許多研究認(rèn)為它是與Th1細(xì)胞有關(guān)的自身免疫性疾病。目前的研究表明，實(shí)驗變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)以及一些腸炎，是由白細(xì)胞介素23(interleukin 23，IL-23)依賴的Th17細(xì)胞或其它分泌IL-17的淋巴細(xì)胞引起的。新型的藥物ustekinumab可以通過阻斷IL-12和IL-23/Th17軸，從而減輕炎癥性腸?。?］，提示Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用，因而中和IL-17A和IL-17F可以作為炎癥性腸病的靶向治療［2-3］。此外臨床常見的自身免疫性疾病特發(fā)性血小板減少性紫癜與大鼠的自身免疫性心肌炎的發(fā)病均與Th17細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子有關(guān)［4-5］。

干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)家族成員與Th17細(xì)胞發(fā)育密切相關(guān)。它存在于多種類型細(xì)胞中，被干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)所誘導(dǎo)。通常IRF8被樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中IFN-γ所誘導(dǎo)，但其作為轉(zhuǎn)錄的激活或者抑制劑，依靠于IRF8異源二聚體DNA結(jié)合點(diǎn)與其它上皮細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄(epithelium-specific transcription，EST)因子家族和IRF家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成不同的復(fù)合物有關(guān)［6］。IRF家族重要成員之一的IRF4不僅對Th2的發(fā)育至關(guān)重要，而且在小鼠EAE模型中，不能發(fā)生EAE與來源于IRF4基因敲除小鼠的Th細(xì)胞不能向Th17分化有關(guān)，提示有利于向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化［7］。已經(jīng)有研究明確IRF8在髓系細(xì)胞分化、促進(jìn)單核細(xì)胞向粒細(xì)胞分化中起到關(guān)鍵性的作用［8］，在DC細(xì)胞發(fā)育、分化和功能各個方面也是至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子［9］，因此對先天性免疫反應(yīng)的建立是必不可少的。盡管IRF8對免疫細(xì)胞的生長、分化和生存的調(diào)節(jié)至關(guān)重要［10］，但是IRF8對T細(xì)胞激活、分化的直接效應(yīng)仍未被完全揭示。重組激活基因(recombination activating gene，RAG)編碼 Ig分子和 TCR基因重排的重組酶，小鼠RAG1或者RAG2基因被敲除后，Ig和TCR既不能重排也不能表達(dá)，表現(xiàn)為T、B淋巴細(xì)胞重癥聯(lián)合缺陷。本研究通過轉(zhuǎn)染IRF8全基因敲除和野生型小鼠初始T細(xì)胞(CD4+CD45RBhiT細(xì)胞)給RAG1-/-小鼠的實(shí)驗性腸炎模型研究，探討轉(zhuǎn)錄因子IRF8是否通過對Th17細(xì)胞分化的影響而調(diào)控小鼠結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展。

材料和方法

1 動物

野生型(WT)C57BL/6(B6)小鼠和IRF8全基因敲除(IRF8-/-)C57BL/6(B6)小鼠購自 Jackson′s Lab，均為雄性，均為 9～10周齡，在特殊無菌(specific pathogen free，SPF)級飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)，溫度18～22℃，濕度50% ～60%。動物實(shí)驗方案得到倫理委員會的同意。

2 脾臟和淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的分離、純化與處理

2.1 小鼠淋巴細(xì)胞的收集 頸椎脫臼法處死各組供體(WT或者IRF8-/-)小鼠，無菌取脾、淋巴結(jié)，用200目篩網(wǎng)碾磨脾臟或者淋巴結(jié)，過濾后收集細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，300×g離心5 min，并用PBS清洗3次，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

2.2 Naive CD4+T細(xì)胞的的分選 Naive CD4+T細(xì)胞(CD4+CD62L+CD44low)的分選采用熒光激活細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分選，CD4+T細(xì)胞采用抗CD4磁珠(Miltenyi Biotec)和MACS分離柱進(jìn)行純化(純度可大于95%)，為了獲得naive CD4+T細(xì)胞，上述獲得的單個細(xì)胞懸液加入抗 B220-PE、抗 CD8α-PE、抗CD11b-PE、抗 CD11c-PE和抗 CD49b-PE，所有的單抗均為1∶100稀釋，抗Ter119-PE采用1∶66稀釋，冰上放置20 min，然后與抗PE磁珠(1∶20稀釋)在冰上孵育 20 min，除去的部分加抗 CD4-PECy7、抗CD62L-FITC和抗CD44-APC，細(xì)胞分選在流式細(xì)胞儀(FACSVantage)上進(jìn)行，獲得的 CD4+CD62L+CD44lowT細(xì)胞，純度＞99%。

2.3 磁珠法分選WT和IRF8-/-小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞 免疫磁珠分選儀(autoMACS Pro Separator)購自Miltenyi Biotec;具體按CD4+CD25+Treg細(xì)胞的分選試劑盒說明書進(jìn)行操作。0.4%臺盼藍(lán)染色后檢測細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞純度＞99%。

2.4 Naive CD4+T細(xì)胞的體外分化 將上述獲得的naive CD4+T細(xì)胞進(jìn)行體外分化培養(yǎng)，細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，加入抗CD3抗體(1 mg/L;BD Biosciences)和可溶性抗CD28(2 mg/L;BD Biosciences)激活48 h后，加入佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)和離子霉素重新刺激5 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)因子。細(xì)胞在中性條件(不加細(xì)胞因子刺激)下培養(yǎng)為Th0細(xì)胞;加入IL-12和抗IL-4(10 mg/L;BD Biosciences)向Th1極化;或者加入IL-4和抗 IFN-γ(10 mg/L;BD Biosciences)向 Th2極化;或者向Th17細(xì)胞極化:轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1;5 μg/L)、IL-6(20 μg/L)、IL-23(10 μg/L)(均購自 R＆D systems)、抗IL-4(10 mg/L)和抗 IFN-γ (10 mg/L)。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測

上述極化后的細(xì)胞，采用IC Fixation緩沖液(BD Biosciences)固定后，采用透膜緩沖液透膜，使用小鼠的抗體，PE-anti-IL-17、APC-anti-IL-4、APC-anti-IFN-γ和PE-Cy5.5-anti-CD4抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，在FACSCalibur和 LSRFortessa(BD Biosciences)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

4 實(shí)驗性腸炎模型的建立

按照文獻(xiàn)［11-12］的方法進(jìn)行T細(xì)胞轉(zhuǎn)染的結(jié)腸炎模型的建立，簡而言之，按照分選純化 WT和IRF8-/-小鼠的naive CD4+CD45RBhiT細(xì)胞和IRF8-/-CD4+CD25+Treg細(xì)胞，使用1×PBS 200 μL、經(jīng)過腹腔注射給RAG1-/-受體鼠(每組6只)，注射的細(xì)胞數(shù)每只均為5×105。每周監(jiān)測受體鼠的體重及臨床表現(xiàn)，第5周后處死受體鼠，結(jié)腸組織在10%的甲醛緩沖液中固定、石蠟包埋，切成5 μm后蘇木精伊紅(HE)染色，按照評分標(biāo)準(zhǔn)［11］進(jìn)行結(jié)腸病理評分，實(shí)驗分組如下:(1)IRF8-/-對實(shí)驗性腸炎的影響:根據(jù)供體鼠實(shí)驗分為:WT組和IRF8-/-組;(2)IRF8-/-CD4+CD25+Treg細(xì)胞對實(shí)驗性腸炎的抑制作用:按照注射細(xì)胞的來源分為WT-CD4+CD45RBhiT組;②WT-CD4+CD45RBhiT+WT Treg組;③WT-CD4+CD45RBhiT+IRF8-/-Treg組。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，組間比較采用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗或ANOVA。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IRF8對小鼠Th1、Th2和Th17分化的影響

小鼠naive CD4+T細(xì)胞在Th17極化條件下，IL-17+CD4+細(xì)胞比例在IRF8-/-小鼠顯著高于WT小鼠(P＜0.01)，而在Th1和Th2極化條件下，Th1和Th2細(xì)胞比例在IRF8-/-和WT小鼠中無顯著差異(P ＞0.05)，見圖1。

2 CD4+CD45RBhiT細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗性結(jié)腸炎模型

分別采用 WT或者 IRF8-/-小鼠的 CD4+CD45RBhiT細(xì)胞，經(jīng) RAG1-/-小鼠(n=6)腹腔注射，每周觀察小鼠體重的變化，結(jié)果顯示注射IRF8-/-小鼠CD4+CD45RBhiT細(xì)胞的RAG1-/-小鼠體重顯著低于注射WT小鼠CD4+CD45RBhiT細(xì)胞的RAG1-/-小鼠(P＜0.05)，見圖2;連續(xù)觀察5周后，處死小鼠，注射IRF8-/-小鼠CD4+CD45RBhiT細(xì)胞的小鼠結(jié)腸病理評分顯著高于WT組(P＜0.05)，見圖3;腸系膜淋巴結(jié)中，IL-17+CD4+T細(xì)胞比例IRF8-/-組顯著高于WT組(P＜0.01)，而Th1(IFN-γ+CD4+)和 Treg(Foxp3+CD4+)細(xì)胞比例無顯著差異(P＞0.05)，見圖4。

3 IRF8－/－CD4+CD25+Treg細(xì)胞對實(shí)驗性腸炎的抑制作用

單獨(dú)注射WT小鼠CD4+CD45RBhiT細(xì)胞后，與注射Treg細(xì)胞2組比較，體重明顯下降(P＜0.05)，而無論同時注射IRF8-/-或者WT小鼠的Treg細(xì)胞，受體鼠體重均未明顯下降，且兩者之間無顯著差異(P ＞0.05)，見圖5。

Figure 1.Naive CD4+T cells from IRF8-/-or WT mouse spleens were cultured under polarized conditions in vitro.Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs WT.圖1 小鼠脾臟naive CD4+T細(xì)胞體外極化培養(yǎng)

Figure 2.Changes of body weight of RAG1-/-mice after injected with WT or IRF8-/-CD4+CD45RBhiT cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs WT CD45RBhi.圖2 RAG1－/－小鼠注射CD4+CD45RBhiT細(xì)胞后體重的變化

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)初始CD4+T細(xì)胞在不同細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下，除分化出 Th1、Th2和Treg細(xì)胞之外，還分化出新型的輔助性T細(xì)胞，產(chǎn)生IL-17，即Th17細(xì)胞，其除在黏膜防護(hù)和病原菌清除中的作用外，在自身免疫性疾病中的作用也得到了較深入的認(rèn)識［10］。其中Th17及IL-17和炎癥性腸?。?-3］和異基因造血干細(xì)胞移植后并發(fā)的移植物抗宿主病［13-14］密切相關(guān)。RORγt是 Th17細(xì)胞分化的決定性轉(zhuǎn)錄因子，但是Th17細(xì)胞分化也受到一些正反饋和負(fù)反饋調(diào)節(jié)，如最近報道的IL-21、IL-23R、IL-10和IL-27調(diào)節(jié)反饋圈的調(diào)節(jié)［15-18］，提示可能存在固有的基因程序激發(fā)和沉默Th17細(xì)胞的發(fā)育，多種轉(zhuǎn)錄因子包括RORγt、RORα、STAT3和IRF4與Th17細(xì)胞的分化密切相關(guān)［10，15］，但是沉默 Th17發(fā)育的機(jī)制目前仍然未完全闡明。

在本研究中，我們闡明了IRF8作為內(nèi)部沉默因子，阻止了初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。我們采用了IRF8全基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，IRF8基因缺失促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，而對Th1和Th2細(xì)胞的分化無影響。我們進(jìn)一步通過免疫介導(dǎo)小鼠炎癥性腸病的模型研究IRF8對炎癥性腸病的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IRF8-/-的 CD4+CD45RBhiT細(xì)胞給RAG1-/-小鼠較WT誘導(dǎo)出更為嚴(yán)重的結(jié)腸炎，在腸系膜淋巴結(jié)的T細(xì)胞重建中IRF8-/-的供體鼠較WT供體鼠顯示出更高的Th17細(xì)胞比例，表明IRF8抑制Th17的免疫反應(yīng)與減輕實(shí)驗小鼠結(jié)腸炎的發(fā)生有關(guān)。

Figure 3.Colonic pathological changes in RAG1-/-mice after injected with WT or IRF8-/-CD4+CD45RBhiT cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs WT CD45RBhi.圖3 RAG1－/－小鼠注射CD4+CD45RBhiT細(xì)胞后結(jié)腸病理變化

Figure 4.Percentages of T cell subtypes in RAG1-/-mouse mesenteric lymph nodes after injected with WT or IRF8-/-CD4+CD45RBhiT cells.Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs WT CD45RBhi.圖4 注射CD4+CD45RBhiT細(xì)胞后RAG1－/－小鼠腸系膜淋巴結(jié)中T細(xì)胞亞群比例

Figure 5.Immunosuppressive effect of IRF8-/-CD4+CD25+Treg cells on experimental colitis in mice.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs other groups.圖5 IRF8－/－CD4+CD25+Treg對小鼠實(shí)驗性腸炎的免疫抑制作用

最近在人IBD結(jié)腸標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，IRF家族中IRF1、IRF5和IRF8表達(dá)無顯著增加，而IRF4顯著增加;在鼠的動物模型中，進(jìn)一步證實(shí)IRF4與IL-17啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)IL-17產(chǎn)生，IL-17誘導(dǎo)表達(dá)IL-17R的細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，促進(jìn)T細(xì)胞RORγt表達(dá)，從而誘導(dǎo)炎癥性腸病發(fā)生［19］。IRF8作為轉(zhuǎn)錄激活劑或者抑制劑依靠靶向DNA序列、并與PU.1或E47不同的伙伴蛋白以及IRF其它家族成員相互作用［6］。最近基因組掃描Meta分析顯示IRF8為多發(fā)性硬化患者的易感基因，更加證明了IRF8在免疫調(diào)控的炎癥性疾病中的作用［20］。

Tregs在維持機(jī)體免疫平衡中作用不可或缺，其不僅可避免IBD的發(fā)生，而且可以逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的腸炎［21］。如果體內(nèi) Tregs與 Th17之間失平衡或者Tregs缺乏，抗原的免疫刺激可導(dǎo)致結(jié)腸黏膜的炎性反應(yīng)。動物實(shí)驗表明，給T細(xì)胞缺陷的小鼠注入不含有Tregs的幼稚T細(xì)胞，可誘發(fā)其對腸道共生菌群的高反應(yīng)性，導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫性結(jié)腸炎;同時輸入Tregs則可抑制這類炎癥反應(yīng)［22］。另有研究表明，剔除小鼠的Treg細(xì)胞會使其 T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病(如腸炎)惡化［23］。本研究將WT小鼠CD4+CD45RBhiT細(xì)胞轉(zhuǎn)染給RAG1-/-小鼠時分別同時轉(zhuǎn)染W(wǎng)T或者IRF8-/-Treg，探討IRF8-/-Treg對炎癥性腸病的抑制作用，發(fā)現(xiàn)IRF8-/-Tregs發(fā)揮了正常的抑T細(xì)胞活性。

(致謝:本研究在美國紐約大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院熊華保副教授悉心指導(dǎo)和大力支持下完成，深表感謝!)

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