實時熒光定量PCR檢測幼兒腹瀉腺病毒

徐志勇 龍 榮 楊 勇 朱海龍 陳 曉＊

腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，依據(jù)病毒株紅細胞凝集能力和DNA的同源性，分為六種類型，即 A、B、C、D、E、F［1-3］。其中 F型的Ad40和Ad41是引起胃腸疾病的主要腺病毒［4，5］。目前檢測腺病毒的主要方法包括病毒培養(yǎng)和血清學檢測。病毒培養(yǎng)存在細胞病變效應和檢測時程較長，并且有的腺病毒株不能在常用培養(yǎng)細胞里復制［1］等問題；血清學檢測存在抗血清價格昂貴、分型技術繁瑣、易出現(xiàn)假陰性結果等弊端。

本研究建立實時熒光定量PCR方法檢測腺病毒Ad40和Ad41，并采集臨床幼兒腹瀉標本與血清學直接免疫熒光法進行平行檢測和對比分析，為腺病毒感染檢測提供新的有效方法。結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床標本收集與處理

2010-09-2013-01，武漢市兒童醫(yī)院門診幼兒腹瀉標本248例，均分成兩份，一份用于直接免疫熒光法檢測，另一份提取病毒DNA［6］，用于實時熒光定量PCR檢測。

1.2 實時熒光定量PCR

1.2.1 引物及探針：Ad40和Ad41引物及探針由上海生工生物工程有限公司合成并標記。引物設計參考序列為 AB610527.1，上游引物：5’-TGT TYG AAG TTT TCG ACG TYG T-3’，下游引物：5’-SAG GTA GAC GGC CTC GAT GA-3’，探針序列：5’-CGCATCCACCAGCCSCACC-3’。在探針5＇端標記熒光報告基團FAM（6-carboxy-fluorescein），3＇端標記熒光淬滅基團 TAMRA （6-carboxy–tetramethy-rhodamine）。

1.2.2 載體構建：用 T-A 載體克隆法［7，8］，將擴增腺病毒DNA片段克隆至pGEM-Teasy載體（中國基康生物技術公司），篩選含有插入片段的載體，用質粒DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取質粒DNA，用紫外分光光度計定量稀釋成不同的濃度梯度 （拷貝數(shù)為101、102、103、104、105、106、107）作為制備標準曲線的模板。

1.2.3 PCR擴增：在50μl體系中含1×Taqman緩沖液，3.5mmol／L MgCl2，200μmol／L dATP、dCTP和 dGTP，400μmol／L dUTP，1.25UampliTaq Gold，0.5UAmp-Erase UNG，腺病毒上下游引物各0.3μmol／L，熒光探針20nmol／L，經(jīng)待測樣品提取的DNA或不同濃度的定量模板DNA。實時熒光定量PCR反應條件：50℃2min，95℃10min；然后95℃15s，60℃30s，共40個循環(huán)，PCR反應結束后，根據(jù)標準曲線由儀器自動分析計算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。PCR試劑盒、PCR反應管、LightCycler PCR儀均為美國羅氏公司產(chǎn)品。所有檢測均在超凈工作臺中進行。每例標本平行檢測三次取均值進行統(tǒng)計學分析。

1.3 直接免疫熒光法

待檢標本涂片待干后滴加0.01mol／L pH7.4的PBS，10min后棄去，使標本保持一定濕度，再滴加熒光標記的抗體溶液（10倍稀釋）（北京中生北控生物科技有限公司提供），使其完全覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫30min。取出玻片，置玻片架上，用0.01mol／L pH7.4的 PBS沖洗后，按順序用0.01mol／L pH7.4的 PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。立即用熒光顯微鏡觀察特異性熒光。

1.4 兩種檢測方法的陽性結果判斷標準

實時熒光定量PCR檢測腺病毒線性范圍為1.0×103-1.0×107。最低檢測限為1.0×103，即實際工作中樣品腺病毒拷貝數(shù)＞1.0×103為腺病毒陽性。直接免疫熒光法結果判斷以標本在熒光顯微鏡下呈綠色熒光為腺病毒陽性（圖1），否則為陰性。

圖1 直接免疫熒光法測定腺病毒的陽性結果（×400）

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件。兩種檢測方法的陽性率和方法學評價指標的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 實時熒光定量PCR與直接免疫熒光法腺病毒陽性檢出率比較

248例幼兒腹瀉標本中，直接免疫熒光法檢出6例腺病毒陽性，陽性檢出率為2.42%（6／248）；實時熒光定量PCR除檢出直接免疫熒光法的6例陽性標本外、還檢出直接免疫熒光法判斷為陰性的13例標本（均已經(jīng)用限制性內(nèi)切酶法進行鑒定并分型確認），陽性檢出率為7.66%（19／248），明顯高于直接免疫熒光法（χ2＝3.675，P＜0.05）。

2.2 實時熒光定量PCR法與直接免疫熒光法檢測腺病毒方法學評價指標比較

實時熒光定量PCR的靈敏度、準確度、陽性預測值、陰性預測值、Kappa指數(shù)均高于直接免疫熒光法（P＜0.05），而特異度與直接免疫熒光法差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩種方法檢測腺病毒方法學評價指標比較

3 討 論

腸道腺病毒是一種能引起播散性腹瀉的病毒，幼兒特別容易感染，病原通常是F組腺病毒Ad40或Ad41。已報道檢測腸道腺病毒的方法有直接免疫熒光法、PCR和限制性核酸內(nèi)切酶技術及其組合檢測等［6，8］，但需要特別設備、昂貴血清及繁瑣技術等的支持。因此，建立快速、簡單、經(jīng)濟的檢測腺病毒方法，不僅有利于臨床觀察，也有助于監(jiān)測腺病毒的地區(qū)性流行情況。

實時熒光定量PCR檢測腸道腺病毒的關鍵是設計引物和探針。基于腸道腺病毒Ad40和Ad41基因序列與其它型別腺病毒序列比對設計引物與探針，能確保實時熒光定量PCR的特異性［9］，但不能區(qū)別Ad40和Ad41病毒。直接免疫熒光法是臨床實驗室檢測腺病毒的常用方法［8］，本文比較實時熒光定量PCR與其檢測結果時發(fā)現(xiàn)，實時熒光定量PCR不僅能驗證直接免疫熒光法檢測的陽性標本，還能在直接免疫熒光法檢測為陰性的242例標本中再檢測出13例陽性結果，表明實時熒光定量PCR的檢出率高于直接免疫熒光法。為了更進一步證實實時熒光定量PCR診斷的正確性，作者用限制性核酸內(nèi)切酶法進行了鑒定并分型，結果顯示19例陽性標本為Ad40和Ad41病毒（資料待發(fā)表）。

總之，本文建立的實時熒光定量PCR方法檢測腸道腺病毒優(yōu)于直接免疫熒光法，可為臨床診斷和治療觀察提供實驗室依據(jù)。

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