趙亞萍，趙錦慧，古紅梅，張永亮

（周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001）

近年來(lái)，隨著飼料工業(yè)的飛速發(fā)展，雖然很多人工合成的飼料添加劑如抗生素、調(diào)味劑、激素、防腐劑、促長(zhǎng)素等在飼料中普遍添加，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展起到了很大的促進(jìn)作用，但其導(dǎo)致的負(fù)面效果如藥物殘留、抗藥性及對(duì)人體等的毒副作用已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外廣大消費(fèi)者和科研工作者的關(guān)注和憂慮.在目前的情況下，純天然的中草藥飼料添加劑以其具有安全特點(diǎn)、能預(yù)防動(dòng)物疾病、改善畜禽產(chǎn)品質(zhì)量、提高畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量而日益受到廣泛關(guān)注，從而促進(jìn)了中草藥飼料添加劑的應(yīng)用和發(fā)展.關(guān)于三叉苦、白英、刺五加、龍葵、半枝蓮等幾味中草藥，其單方抑菌作用研究有報(bào)道［1－10］，但有關(guān)這幾味中草藥的復(fù)方制劑抑菌性能研究鮮有報(bào)道.筆者通過(guò)測(cè)定抑菌率、最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）、抑菌圈大小等指標(biāo)，對(duì)三叉苦等5味中草藥組配的9個(gè)復(fù)方制劑的抑菌性能進(jìn)行研究，旨在為開(kāi)發(fā)和利用中草藥飼料抗菌添加劑提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材

三叉苦、白英、刺五加、龍葵、半枝蓮，購(gòu)于周口市同和堂大藥店.

1.1.2 供試菌種

大腸桿菌，由周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院提供.

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基.

1.1.4 實(shí)驗(yàn)器具

實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、干燥箱、超凈工作臺(tái)等.

低值易耗品：試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、燒杯、量筒、濾紙、酒精燈、萬(wàn)用電爐、毫米刻度尺、砂鍋、脫脂棉等.

1.2 方法

1.2.1 三叉苦等5味中草藥復(fù)方制劑活性成分的提取

方1：稱(chēng)取三叉苦20g，白英20g，刺五加20 g；方2：稱(chēng)取三叉苦20g，白英20g，龍葵20g；方3：三叉苦20g，白英20g，半枝蓮20g.3個(gè)配方中分別加入400mL的蒸餾水，文火加熱煮沸1h，用紗布過(guò)濾后得提取液，濾渣用4倍水量煎煮2次后棄去，將3次所得濾液混合并濃縮到60mL 使提取液原液濃度達(dá)到1g／mL.方4：稱(chēng)取三叉苦20 g，白英20g，刺五加20g，龍葵20g；方5：稱(chēng)取三叉苦20g，白英20g，刺五加20g，半枝蓮20g；方6：稱(chēng)取三叉苦20g，白英20g，半枝蓮20g，龍葵20g.同法制備，使提取液原液濃度達(dá)到1g／mL.方7：稱(chēng)取三叉苦15g，白英15g，刺五加15g，龍葵15g，半枝蓮15g；方8：稱(chēng)取三叉苦20g，白英10g，刺五加10g，龍葵15g，半枝蓮20g；方9：稱(chēng)取三叉苦15g，白英20g，刺五加10g，龍葵20g，半枝蓮10g.同法制備，使提取液原液濃度達(dá)到1 g／mL.

將上述各個(gè)配方所得提取液在121.3℃下高壓蒸汽滅菌20min后，4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 普通培養(yǎng)基及藥液培養(yǎng)基的制備

普通培養(yǎng)基的制備［11］：制備牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基.

藥液培養(yǎng)基的制備［12］：將滅菌的提取液原液用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e得到含提取液為0.5g／mL，0.25g／mL，0.125g／mL的藥液培養(yǎng)基.

1.2.3 菌種活化、菌懸液的制備及篩選［13，14］

用無(wú)菌接種環(huán)分別從試管斜面上挑取大腸桿菌少許接種于斜面上，37℃活化培養(yǎng)24h.分別挑取活化后的大腸桿菌單個(gè)菌落放入無(wú)菌生理鹽水中制備成菌液，采用菌懸液OD值測(cè)定及平板菌落計(jì)數(shù)法調(diào)節(jié)菌液稀釋度，使菌體密度為102cfu／mL.

1.2.4 抑菌率的測(cè)定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法［14］統(tǒng)計(jì)9個(gè)復(fù)方中草藥提取液不同濃度下的抑菌率，設(shè)對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，抑菌率取3個(gè)重復(fù)的平均值.

1.2.5 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定［15，16］

在裝有1mL藥液培養(yǎng)基的各試管中加入0.1 mL的菌懸液（菌懸液的菌體密度為102cfu／mL），37℃恒溫條件下振蕩培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果.以試管中無(wú)渾濁現(xiàn)象出現(xiàn)的最低藥液濃度作為MIC，每個(gè)濃度下均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照管.

1.2.6 最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定［17］

以MIC測(cè)定結(jié)果為基礎(chǔ)，從未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的各管培養(yǎng)物中吸取0.1mL涂布平板，37℃條件下培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，菌落數(shù)少于5個(gè)的最小稀釋度即是最小殺菌濃度.

1.2.7 抑菌圈大小測(cè)定

采用藥敏紙片法［18，19］測(cè)定各個(gè)復(fù)方中草藥提取液的抑菌圈直徑.將濾紙用打孔器制成6mm的小圓紙片，高壓滅菌后放入1g／mL的各個(gè)復(fù)方中草藥提取液中，浸泡1～2h，制成藥敏紙片，干燥后備用，對(duì)照用無(wú)菌水浸泡.吸取0.1mL的菌懸液于平板中央，用玻璃涂棒將菌液均勻涂布于平板上.含菌平板倒置干燥約30min后，用無(wú)菌鑷子取藥敏紙片均勻貼在平板上，每個(gè)平板貼3個(gè)藥敏紙片，每個(gè)處理做3個(gè)平板.20min后，將平板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24h.用毫米刻度尺測(cè)量抑菌圈直徑，以3個(gè)平板的平均值表示抑菌圈直徑.

藥敏紙片法可參考以下標(biāo)準(zhǔn)記錄結(jié)果：抑菌圈為16～20mm，表示高度敏感；11～16mm，表示中度敏感；10～11mm表示輕度敏感；小于10mm，表示不敏感.

2 結(jié)果與分析

2.1 5味中草藥組配的9個(gè)復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的抑菌率

9個(gè)復(fù)方制劑在不同濃度下對(duì)大腸桿菌的抑菌率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可知：各個(gè)濃度下，9個(gè)復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌均有不同程度的抑制作用，且抑菌效果隨著復(fù)方制劑濃度的增大而增強(qiáng).當(dāng)濃度為0.5g／mL時(shí)，9個(gè)復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的體外抑菌作用強(qiáng)度為方9＞方5＞方3＞方7＞方6＞方8＞方1＞方4＞方2；當(dāng)濃度為0.25g／mL和0.125g／mL時(shí)，9個(gè)復(fù)方制劑的抑菌作用強(qiáng)度均為方5＞方9＞方3＞方7＞方6＞方8＞方4＞方1＞方2.此結(jié)果顯示，復(fù)方制劑的抑菌效果強(qiáng)弱和其包含的中草藥種類(lèi)多少并非呈正相關(guān)，并不是配伍的中草藥種類(lèi)越多，抑菌效果就越強(qiáng).此外，方1、方2、方3均包含3味藥材，其中2味相同，1味不同；方4、方5均包含4味藥材，其中3味相同，1味不同；方4、方6均包含4味藥材，其中3味相同，1味不同；方5、方6均包含4味藥材，其中3味相同，1味不同.其抑菌率顯示明顯的差異，這表明復(fù)方制劑的抑菌效果和配伍的中草藥種類(lèi)有密切關(guān)系.最后，方7、方8、方9均由相同的5味中草藥配伍而成，僅各中草藥的用量有差異，但其抑菌率也差異明顯，這說(shuō)明復(fù)方制劑的抑菌效果和各中草藥之間的用量配比關(guān)系密切.

2.2 5味中草藥組配的9個(gè)復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小

9個(gè)復(fù)方制劑在1g／mL濃度下對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可知：9個(gè)復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小存在差異，大腸桿菌對(duì)方9表現(xiàn)出高度敏感，對(duì)方3、方5、方6、方7表現(xiàn)出中度敏感，對(duì)方1、方4、方8表現(xiàn)出輕度敏感，對(duì)方2表現(xiàn)出不敏感.從抑菌圈大小測(cè)定結(jié)果看，9個(gè)復(fù)方制劑在1g／mL濃度下的抑菌強(qiáng)度為方9＞方5＞方3＞方6＞方7＞方8＞方4＞方1＞方2.這與上述抑菌率統(tǒng)計(jì)結(jié)果不一致，說(shuō)明復(fù)方制劑的濃度對(duì)抑菌效果影響明顯，每個(gè)復(fù)方制劑都有一個(gè)抑菌殺菌效果較好的合適濃度.

表1 9個(gè)復(fù)方制劑在不同濃度下對(duì)大腸桿菌的抑菌率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 9個(gè)復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 9個(gè)復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

不同濃度的復(fù)方制劑下大腸桿菌的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3，9個(gè)復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度與最小殺菌濃度統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4.由表3可知，方5、方9在0.5g／mL和0.25g／mL的濃度下，試管內(nèi)均無(wú)渾濁現(xiàn)象；方3、方6、方7、方8在0.5g／mL的濃度下，試管內(nèi)無(wú)渾濁現(xiàn)象，其余各管中均有不同程度的渾濁現(xiàn)象.從表4可以看出，方5的MIC和MBC均為0.25g／mL；方9的 MIC為0.25g／mL，MBC為0.5g／mL；方3、方6、方7、方8的MIC均為0.5g／mL，但其MBC未確定；其余各方的MIC和MBC均未確定.

表3 不同濃度的復(fù)方制劑下大腸桿菌的生長(zhǎng)情況

表4 9個(gè)復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度與最小殺菌濃度

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同中草藥組配的復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌的抑菌、殺菌效果不同，同一種復(fù)方制劑不同濃度下，大腸桿菌對(duì)其敏感性不同.抑菌效果強(qiáng)弱并非由復(fù)方制劑中所含的中草藥種類(lèi)多少?zèng)Q定，而是由復(fù)方制劑中所含的中草藥種類(lèi)及各種中草藥之間的用量配比所決定.

研究發(fā)現(xiàn)在抑菌率、抑菌圈大小等指標(biāo)統(tǒng)計(jì)上，不同濃度下9個(gè)復(fù)方制劑的抑菌效果強(qiáng)弱排序并不一致，可能因?yàn)橹胁菟帍?fù)方制劑作用機(jī)制復(fù)雜，多種中草藥自身的化學(xué)成分之間會(huì)相互發(fā)生反應(yīng)，而且活性成分提取中條件上存在的稍微差異也會(huì)造成最終的有效成分含量有差異，從而影響抑菌效果.

中草藥屬于純天然的物質(zhì)，具備營(yíng)養(yǎng)與治療2種功效，具有與食物同體、同源、同用的特點(diǎn)，很多中草藥人類(lèi)和動(dòng)物是可以食用的，這也是抗生素、現(xiàn)代化學(xué)合成藥物等無(wú)法比擬的［20］.對(duì)中草藥復(fù)方制劑作為飼料中的防病抗病添加劑或者作為營(yíng)養(yǎng)添加劑的研究［21］較少，而且目前實(shí)際應(yīng)用作為飼料添加劑的中草藥品種并不多，因此有待進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā).

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