程燕,陳琳,曹忻,哈斯其美格,謝小冬

1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)研究所,蘭州730000;2.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,蘭州730030;3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院感染科,蘭州730000

化學(xué)治療是臨床治療胃癌及多種惡性腫瘤的重要手段。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)作為臨床上應(yīng)用最廣泛的嘧啶類抗代謝藥物,對(duì)胃癌及其他消化道癌具有良好的療效。但在臨床治療過程中發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期應(yīng)用氟尿嘧啶會(huì)使腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物由最初的敏感到敏感性下降,直到不敏感而產(chǎn)生獲得性耐藥[1]。腫瘤的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜,最近的研究報(bào)道證實(shí)microRNA(miRNA)與腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性存在一定相關(guān)性。

miRNA是一類約22個(gè)核苷酸大小的單鏈非編碼 RNA,它們通過剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯從而起到轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控靶基因表達(dá)的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA除了在個(gè)體發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞增殖、分化與凋亡以及疾病發(fā)生等方面起重要作用外,還與多種腫瘤多藥耐藥的發(fā)生顯著相關(guān)[3]。調(diào)控腫瘤化療相關(guān)基因的miRNA如果發(fā)生了突變、異常表達(dá)和異常加工,均會(huì)影響到腫瘤細(xì)胞的藥物敏感度[4,5]。本研究應(yīng)用基因芯片篩選獲得在胃癌氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞株中異常表達(dá)的 hsamiR-125b,通過對(duì)hsa-miR-125b的靶基因預(yù)測(cè)、基因注釋、功能分析以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集等一系列生物信息學(xué)分析,為進(jìn)一步研究hsa-miR-125b在胃癌氟尿嘧啶獲得性耐藥過程中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 耐藥細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)以及miRNA的檢測(cè)

人低分化胃腺癌細(xì)胞株BGC823應(yīng)用氟尿嘧啶進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥,藥物濃度由 10 mg/L培養(yǎng)液終濃度開始遞增,通過多次誘導(dǎo)培養(yǎng),氟尿嘧啶培養(yǎng)液藥物終濃度達(dá) 50 mg/L,通過 MTT檢測(cè)兩種細(xì)胞的IC50,耐藥指數(shù)大于18.75,獲得耐藥細(xì)胞株BGC823/Fu。分別提取細(xì)胞的總RNA,紫外分光光度儀測(cè)定A260/280,確定RNA純度合格后,送上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)。本研究采用 Agilent human miRNA V18.0芯片檢測(cè)兩種細(xì)胞的 miRNA表達(dá)譜,該芯片覆蓋 1 908個(gè)人類相關(guān)miRNA。芯片結(jié)果應(yīng)用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描,采用Feature Extraction software 10.7讀取數(shù)據(jù),最后應(yīng)用Gene Spring Software 11.0進(jìn)行歸一化處理。

將BGC823作為對(duì)照組,以BGC823/Fu細(xì)胞中miRNA表達(dá)差異>2.0或<0.5作為篩選條件,進(jìn)行芯片結(jié)果篩選,確定 hsa-miR-125b-5p(引物 hsa-mir-125b-5p：HmiRQP0096; U6：HmiRQ9001; FulenGen)為本次研究對(duì)象,并進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性10 s,55℃復(fù)性20 s,72℃延伸10 s,共進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。以 2-DDCt表示 miRNA 的表達(dá)水平,?Ct＝Ct樣本 miRNA-Ct參照 U6,每個(gè)樣本重復(fù) 3 次實(shí)驗(yàn)。

1.2 hsa-miR-125b的基本生物學(xué)信息

通 過 miRbase[6](http://www.mirbase.org)查 找hsa-miR-125b序列,應(yīng)用 NCBI Mapviewer、UCSC Genome Browser等在線工具,獲取hsa-miR-125b染色體定位、物種保守性等基本信息。

1.3 hsa-miR-125b靶基因的預(yù)測(cè)

應(yīng)用 TargetScan6.2(http://www.targetscan.org/)、PicTar(http://www.pictar.org/)及miRanda(http://www.microrna.org/)三大靶基因預(yù)測(cè)軟件[7,8]對(duì) hsa-miR-125b進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),取三者預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)的交集再結(jié)合miTarbase[9](http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)中已經(jīng)證實(shí)的靶基因形成靶基因集合用于后續(xù)分析。

1.4 靶基因的Gene Ontology(GO)分析

應(yīng)用 DAVID 數(shù)據(jù)庫(http://abcc.ncifcrf.gov/)對(duì)hsa-miR-125b的靶基因集合進(jìn)行 GO注釋描述,應(yīng)用 BiNGO 對(duì)靶基因的生物學(xué)過程(Biological process,BP)和分子功能(Molecular function,MF)進(jìn)行 GO注釋層次分類及富集分析以及顯著性分析,以P<0.001為顯著性閾值,分別得到具有統(tǒng)計(jì)意義的高頻率注釋。

1.5 靶基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)中Pathway子數(shù)據(jù)庫對(duì)hsa-miR-125b的靶基因進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析,通過Fisher Exact Test計(jì)算P值,以P<0.01代表靶基因集合相對(duì)于背景具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及疾病通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA 表達(dá)譜芯片結(jié)果

芯片結(jié)果顯示：與 BGC823相比,BGC823/Fu有29個(gè)miRNA表達(dá)差異大于2倍或小于0.5倍,其中上調(diào)表達(dá)的miRNA有17個(gè),主要包括hsa-miR-192-5p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-let-7c、hsa-miR-331-3p等; 下調(diào)表達(dá)的miRNA有12個(gè),主要包括 hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-100-5p等。

選取芯片結(jié)果中差異最為顯著的10個(gè)miRNA,應(yīng)用 RT-qPCR進(jìn)行芯片結(jié)果驗(yàn)證,證實(shí)有 7個(gè)miRNA與芯片結(jié)果一致,其中 hsa-miR-125b-5p的芯片結(jié)果顯示 Foldchange下調(diào)了 24.7倍,而 RT-qPCR結(jié)果顯示也下調(diào) 3.5倍,差異具有顯著性(P<0.05),故本文選擇hsa-miR-125b-5p作為對(duì)象進(jìn)行重點(diǎn)分析,其他 miRNA因差異沒有 hsa-miR-125b-5p顯著,故作為次要結(jié)果另行分析,不在本文中討論。Hsa-miR-125b-5p的RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果見圖1。

圖1 hsa-miR-125b-5p在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2 hsa-miR-125b的基因定位及保守性分析

由 miRbase數(shù)據(jù)庫獲得的序列信息可知 hsamiR-125b定位于人染色體11q24.1,包括人在內(nèi)的9個(gè)物種(人、大鼠、小鼠、短尾負(fù)鼠、中國倉鼠、雞、獼猴、馬、真渦蟲)間的序列“ucccugagacccuaacuuguga”具有高度的保守性,提示其在生物體內(nèi)可能具有重要的生物學(xué)功能。各物種中miR-125b的成熟體序列號(hào)、名稱、前體的染色體定位以及保守序列詳細(xì)信息見表1。

2.3 hsa-miR-125b靶基因預(yù)測(cè)

應(yīng)用TargetScan6.2、PicTar及MiRanda分別預(yù)測(cè)了hsa-miR-125b靶基因數(shù)量,分別為814、562、2 592個(gè),對(duì)3種預(yù)測(cè)方法的結(jié)果數(shù)據(jù)取交集共獲得62個(gè)靶基因。另外,miTarbase數(shù)據(jù)庫中記錄的經(jīng)其他研究應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和/或Northern blotting方法證實(shí)的hsa-miR-125b靶基因共有34個(gè),其中有 17個(gè)靶基因與上述預(yù)測(cè)集合中的數(shù)據(jù)結(jié)果一致,占預(yù)測(cè)靶基因總數(shù)的 27%,說明預(yù)測(cè)結(jié)果具一定可靠性。合計(jì)預(yù)測(cè)靶基因與已驗(yàn)證靶基因,共計(jì)獲得 79個(gè)靶基因的數(shù)據(jù)集合用于后續(xù)的基因注釋和通路富集分析。部分預(yù)測(cè)的靶基因見表2。

2.4 靶基因功能富集分析

應(yīng)用 DAVID 數(shù)據(jù)庫和 GO數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因功能進(jìn)行富集分析,結(jié)果顯示：從分子功能看,hsamiR-125b的靶基因主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子的激活,以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì) N末端、C末端、蛋白質(zhì)二聚體等蛋白質(zhì)的結(jié)合; 此外,還可調(diào)節(jié)肽酶、肽類轉(zhuǎn)移酶的活性以及調(diào)節(jié)微管、錳離子、銅離子的結(jié)合等(P<0.001),見表3。

表1 不同物種miR-125b的序列同源性分析

表2 部分預(yù)測(cè)的hsa-miR-125b的靶基因

從生物學(xué)過程看,hsa-miR-125b的靶基因主要參與蛋白質(zhì)氨基酸的磷酸化與去磷酸化、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正負(fù)性調(diào)控以及DNA 依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié); 參與發(fā)育過程、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的負(fù)性調(diào)控和細(xì)胞凋亡的正負(fù)性調(diào)控; 此外,還參與了Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞因子刺激反應(yīng)性、藥物反應(yīng)性和 DNA損傷反應(yīng)性等生物學(xué)過程(P<0.001),見表4。

2.5 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析結(jié)果顯示：hsa-miR-125b靶基因集合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著富集于MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路; 另外還涉及到細(xì)胞周期過程、細(xì)胞凋亡過程、細(xì)胞粘附以及前列腺、胰腺、膀胱、肺等多種組織的腫瘤通路中(P<0.01),見表5。

3 討 論

近年來,越來越多的研究表明miRNA表達(dá)水平的改變能影響其對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而改變靶蛋白的表達(dá)水平,最終影響腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性[10]。本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-125b在胃癌氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞株中表達(dá)水平顯著下調(diào),提示 hsa-miR-125b與胃癌細(xì)胞的氟尿嘧啶耐藥性之間有一定的相關(guān)性。

miR-125家族成員有 hsa-miR-125a、hsa-miR-125b-1和hsa-miR-125b-2。miR-125a定位于染色體19q13,miR-125b定位于染色體 11q24.1(hsa-miR-125b-1) 和 21q21(hsa-miR-125b-2),分別由這兩個(gè)位點(diǎn)的5′端剪切形成同一成熟體。miR-125b在多個(gè)物種中呈序列高度保守性[11]且并具有雙重的生物學(xué)功能,既可以作為抑癌基因,抑制腫瘤的發(fā)生; 也可以作為促癌基因,在腫瘤組織中高表達(dá)。

表3 hsa-miR-125b預(yù)測(cè)靶基因的GO分子功能分類

已報(bào)道的研究發(fā)現(xiàn)[12,13],hsa-miR-125b與多種腫瘤的化療敏感性有關(guān),但miR-125b的表達(dá)差異與組織或細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性并不一致。miR-125b表達(dá)下調(diào)可以引起腫瘤耐藥的發(fā)生。例如：miR-125b-1在乳腺癌 SKBR-3細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),當(dāng)轉(zhuǎn)染外源性的miR-125b-1使其在乳腺癌細(xì)胞中高度表達(dá)后,它所負(fù)性調(diào)節(jié)的靶基因Her2表達(dá)下調(diào),進(jìn)而抑制了細(xì)胞的分裂、增殖和轉(zhuǎn)化,并通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)分子的表達(dá)使細(xì)胞阻滯于 G2M 期,從而增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性[14]; 智慧等[15]研究發(fā)現(xiàn)胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中miR-125b表達(dá)下調(diào),抑制靶基因BCL2、MCL1的作用減弱,促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥性。這些研究表明在細(xì)胞耐藥過程中,miR-125b主要起到了抑癌基因的作用,當(dāng)miR-125b表達(dá)下調(diào)時(shí),它的抑癌作用和促細(xì)胞凋亡作用減弱,從而引起耐藥的發(fā)生。然而,另外一些研究發(fā)現(xiàn) miR-125b表達(dá)上調(diào)又可以引起腫瘤耐藥的發(fā)生。Kong等[16]研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞株中miR-125b表達(dá)上調(diào),通過進(jìn)一步靶向調(diào)節(jié)BAK1從而抑制化療藥物順鉑的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡,繼而增加細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性,說明miR-125b主要起到了原癌基因的作用,當(dāng)miR-125b表達(dá)上調(diào)時(shí),它的促癌作用進(jìn)一步加強(qiáng)進(jìn)而引發(fā)耐藥。

從上述結(jié)果看,雖然miR-125b在細(xì)胞中的表達(dá)變化情況并不一致,但都顯示出miR-125b主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖來影響腫瘤化療敏感性,這可能與miR-125b具有的雙重生物學(xué)作用有關(guān)。此外,Shi等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-125b的正常表達(dá)有助于使細(xì)胞分裂正常停止在G1/S轉(zhuǎn)變點(diǎn),而人U251膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中miR-125b的低表達(dá)

使細(xì)胞增殖繞過了G1/S檢查點(diǎn)而大量增殖進(jìn)而發(fā)生化療耐藥,說明miR-125b還可以通過作用細(xì)胞周期環(huán)節(jié)來影響腫瘤化療耐藥性。它所調(diào)控的靶基因在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等過程中具有重要的生物學(xué)功能。

表4 hsa-miR-125b預(yù)測(cè)靶基因的GO生物學(xué)過程分類

目前,已有大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與多種腫瘤的耐藥性密切相關(guān)。本文通過對(duì) hsamiR-125b的靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析,發(fā)現(xiàn) hsa-miR-125b的靶基因主要富集于MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路,并參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的正負(fù)性調(diào)控以及細(xì)胞因子刺激反應(yīng)性、藥物反應(yīng)性、DNA損傷反應(yīng)性等生物學(xué)過程中。在MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、JNK氨基末端激酶(JNK/SAPK)和P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)都參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化過程,miR-125b通過調(diào)控這些通路中靶基因的表達(dá),進(jìn)而影響到細(xì)胞的增殖和凋亡,改變了腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性[18～21]。Wnt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化的關(guān)鍵通路之一,其中經(jīng)典的 Wnt/β-catenin通路主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡過程。周秀懷[22]研究發(fā)現(xiàn)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠增加食管癌順鉑化療敏感性; 此外,還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路與肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥性、與胰腺癌對(duì)吉西他濱耐藥性、與乳腺癌的多藥耐藥性、與結(jié)腸癌干細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)[23～26]; p53作為抑癌基因與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡有關(guān),p53突變或表達(dá)異?？蓪?dǎo)致化療耐受,它通過精細(xì)的調(diào)控機(jī)制引起一系列基因包括其它腫瘤抑制基因表達(dá)的改變,從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、激活 DNA修復(fù)和凋亡機(jī)制。p53通路下游靶基因的活化及p53與其他分子/基因間的相互作用都會(huì)影響腫瘤的耐藥性[27～30]。除了上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用,化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)還會(huì)通過直接引起細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡等過程來實(shí)現(xiàn)。有研究報(bào)道m(xù)iRNA通過與細(xì)胞凋亡抑制因子的靶向調(diào)控、與細(xì)胞周期調(diào)控因子的負(fù)性調(diào)節(jié)來影響藥物作用的發(fā)揮,最終導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生[31～34]。

基于本文生物信息學(xué)分析和已有的研究結(jié)果,BGC823/Fu細(xì)胞株中 hsa-miR-125b表達(dá)顯著下調(diào),有可能通過上調(diào)MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路,以及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路和生物學(xué)過程中的靶基因,進(jìn)而增加了胃癌的細(xì)胞增值能力和抗凋亡的能力,降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,最終改變了胃癌對(duì)氟尿嘧啶的藥物反應(yīng)性。這一結(jié)果為研究hsa-miR-125b在腫瘤耐藥過程中的調(diào)控機(jī)制和作用機(jī)理,提供了可靠的研究線索和可行的研究策略,也為miRNA作為靶點(diǎn)恢復(fù)腫瘤對(duì)藥物的敏感性提供了研究基礎(chǔ)[35]。

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