優(yōu)化玫瑰紅鵝膏培養(yǎng)條件及抑菌活性研究*

張 楠，包海鷹

(吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

鵝膏菌是一個世界性分布的大屬，有毒蘑菇中最重要的一類。目前已定名的約有500多種[1]。屬于擔子菌亞門 (Basidiomycotina)、層菌綱 (Hymenomycetes)、傘菌目 (Agaricales)、鵝膏科 (Amanitaceae)、鵝膏屬 (Amanita Pers.:Gray)[2]。鵝膏菌中主要的毒素為肽類毒素，共有3大類22種，分別為鵝膏毒肽 (Amatoxins)9種、鬼筆毒肽 (Phallotoxins)7種和毒傘素 (Vrotoxins)6種。肽類毒素由于獨特的生物學特性，目前廣泛應用于生物學、醫(yī)學、遺傳學、生物化學、基因工程，病毒等研究領域[3－5]。由于鵝膏屬大多數(shù)與針科或殼斗可形成外生菌根菌[6]，尚無人工栽培。國內(nèi)毒素來源美國Sigma公司，每毫克價格在1.2×105美元～1.4×105美元。

因為鵝膏屬在真菌中的關鍵性地位以及其毒素的特殊性，人工培養(yǎng)鵝膏菌的努力從來沒有停止過。為了更方便地研究鵝膏菌，人工純培養(yǎng)正在逐步成為一個研究熱點[7]。

依據(jù)包海鷹教授多年來對長白山產(chǎn)鵝膏屬真菌的調查研究，以及對7種長白山產(chǎn)鵝膏屬真菌肽類毒素的高效液相分析[8，9]，發(fā)現(xiàn)了玫瑰紅鵝膏 A.pallidorosea，其具有資源豐富、毒素含量高等特點。本試驗對玫瑰紅鵝膏進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并對發(fā)酵產(chǎn)物中的肽類毒素進行分離提取，研究其藥理活性，為毒素獲得提供新的資源，進一步豐富了鵝膏毒肽藥理作用方面的研究內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玫瑰紅鵝膏Amanita pallidorosea，采自吉林省輝南縣朝陽鎮(zhèn)樣子哨。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀;色譜分析柱:分析柱YWG－C18柱 (150 mm×4.6 mm，10 μm)，北京分析儀器廠，半制備柱 VenusⅡ MP－C18柱 (250 mm ×10 mm，10 μm)，Agela Technologies;二氧化碳培養(yǎng)箱，NAPCO法國;離心機SORVALL;電子分析天平，SHIMADZU－AUY220型。

1.2.2 試劑

醋酸銨 (美國Sigma公司);乙腈和甲醇 (色譜純);冰醋酸和石油醚 (分析純);洗脫液A相:10%乙腈和90%0.02 mol·L－1醋酸銨，冰醋酸調節(jié)pH值至5.0;洗脫液B相:30%乙腈和70%濃度0.02 mol·L－1醋酸銨，冰醋酸調節(jié)pH值至5.0;純凈水 (杭州娃哈哈公司)。

標準品:a－鵝膏毒肽 (a－AMA)、β－鵝膏毒肽 (β－AMA)、二羥鬼筆毒肽 [Phalloidin(PHD)]，以上3種標準品均由吉林農(nóng)業(yè)大學菌物研究所提供。

1.3 液體深層培養(yǎng)方法

1.3.1 基礎培養(yǎng)基 (改良PDM)

馬鈴薯 200 g·L－1、葡萄糖 20 g·L－1、磷酸二氫鉀3 g·L－1、硫酸鎂 0.5 g·L－1、磷酸氫氨 0.5 g·L－1、氯化鈣0.05 g·L－1、硝酸鉀 0.1 g·L－1、麥芽汁 (12 波美度)120 mL、VB10.01 g·L－1。

1.3.2 菌種培養(yǎng)

斜面菌種于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d后，將適量菌絲接入最適培養(yǎng)基中，然后置于恒溫振蕩器上，150 r·min－1振蕩培養(yǎng)10 d。

搖瓶發(fā)酵:250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)液，接種量5%(v·v－1)，置于 26℃恒溫振蕩器上，150 r·min－1振蕩培養(yǎng) 25 d。取25 d的發(fā)酵菌絲體，于烘箱中60℃烘至恒重，電子天平稱重并記錄。

1.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

試驗設計采用中心組合旋轉設計 (Box－Benhnken)法，對溫度 (A)、pH值 (B)和轉速 (C)進行優(yōu)化設計。各因素及其編碼水平的設計見表1。

表1 中心組合旋轉設計的變量及水平

1.4 發(fā)酵產(chǎn)物中肽類毒素的檢測

1.4.1 粗毒液的制備

菌種培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液過濾，收集濾渣和濾液，把菌絲體在60℃下烘干后研磨。取1 g研磨后的菌絲體粉末，溶于10 mL 50%甲醇中，室溫下振蕩抽提24 h，8 000 r·min－1離心收集上清液。沉淀以10 mL 50%甲醇室溫下振蕩抽提24 h，8 000 r·min－1離心收集并合并上清液。用石油醚去脂2次，然后冷凍干燥，凍干的樣品用超純水溶解，再用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得到鵝膏粗毒液。

1.4.2 HPLC測定參數(shù)

使用安捷倫1100高效液相色譜儀分離梯度模式為:0→15 min，B 0→5%，A 100%→95%;15 min→35 min，B 5%→80%，A 95%→20%;35 min→40 min，B 80%，A 20%;40 min→45 min，B80%→100%，A20%→0%;45 min→50 min，B 100%;50 min→55 min，B 100%→0%，A 0→100%并保持10 min。純化梯度模式:與分離梯度模式相同。檢測波長:295 nm;柱溫:40℃;流速:分析柱1 mL·min－1;半制備柱:2 mL·min－1。進樣量:分析柱 10 μL，半制備柱 1 mL。

1.4.3 HPLC分離純化

先在分析柱上篩選出最適宜的色譜條件，后在半制備柱上進行毒素的分離和純化，得到2種化合物。冷凍干燥后，用高效液相進行檢測。分離純化結果用Finnigan－MAT.LCQ電噴霧質譜儀進行鑒定。

1.5 對植物病原菌的抑制活性

1.5.1 供試病原真菌

香瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學菌物研究所提供。

1.5.2 指示菌的培養(yǎng)

首先將試管斜面保存的菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，等菌種長好后，用直徑7 mm的打孔器制成菌塊。

1.5.3 供試品對菌絲生長的影響

采用生長速率法[10－12]。取質量濃度為 105 μg·mL－1的粗提物溶液200 μL，混合于100 mL的PDA培養(yǎng)基中，配制以下濃度的含毒培養(yǎng)基，即玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液:200 μg·mL－1[13]、100 μg·mL－1、50 μg·mL－1;發(fā)酵產(chǎn)物:800 μg·mL－1、400 μg·mL－1、200 μg·mL－1;不添加任何供試品的平板培養(yǎng)基作為空白對照。每個樣品設置3個重復。將已制好的菌塊接種于含毒的平板培養(yǎng)基中，置于26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。然后，用十字交叉法測抑菌率 (%)，公式為:

式中:R1為對照菌落直徑;R2為處理菌落直徑。

1.5.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，計數(shù)資料采用x±SD表示。p＜0.05說明在統(tǒng)計學上呈顯著差異，p＜0.01說明在統(tǒng)計學上呈極顯著差異，有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 液體深層培養(yǎng)

2.1.1 不同溫度對菌絲體重量的影響

設置20℃、23℃、26℃、30℃、33℃、36℃共計5個不同的溫度處理 (溫度變幅為±1℃)，結果見圖1。

結果表明，玫瑰紅鵝膏菌絲體在26℃下培養(yǎng)，菌絲體干物質重量最高，生長狀態(tài)最好。當溫度達到33℃時，菌絲體生長極其緩慢，當溫度達到36℃時，菌絲體基本停止生長。可能溫度過高會導致菌體內(nèi)的酶活性降低或者喪失。

2.1.2 不同pH值對菌絲體重量的影響

設置4、5、6、7、8共計5個不同的 pH值處理。用1 mol·L－1的HCl和NaOH調節(jié)培養(yǎng)基的pH值，結果見圖2。

結果表明，玫瑰紅鵝膏菌絲體在pH值為6的條件培養(yǎng)時，菌絲體干物質重量最高。

2.1.3 不同轉速對菌絲體重量的影響

設置 80 r·min－1、100 r·min－1、120 r·min－1、140 r·min－1、160 r·min－1共計5個不同的轉速處理，結果見圖3。

結果表明，玫瑰紅鵝膏菌絲體在140 r·min－1振蕩培養(yǎng)時，菌絲體干物質重量最高。

2.1.4 Box－Benhnken實驗分析

中心組合旋轉試驗設計及結果見表2。

表2 中心組合旋轉試驗設計及結果

本試驗以玫瑰紅鵝膏菌絲體干重 (g)為響應變量，以溫度 (A)、pH值 (B)和轉速 (C)為影響因子，進行 Box－Behnken響應面分析，利用統(tǒng)計軟件SAS8.0對試驗結果進行統(tǒng)計分析，可建立二次回歸方程 (編碼后):

Y=+1.00－0.018×A+0.020×B+0.068×C+0.052×A×B+5.500E－003×A×C+0.055×B×C－0.15×A2－0.16×B2－0.061×C2，相關系數(shù) R2=99.67%，修正相關系數(shù) R2Adj=99.24%。

對二次回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 二次回歸方程方差分析表

回歸模型達到極顯著水平 (p＜0.01)而誤項不顯著，說明回歸方程與實際情況較吻合，試驗誤差小，因此可利用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。由表3可知，模型的一次項A、B、C極顯著;二次項均極顯著;交互項AB、BC極顯著，AC不顯著。這表明各種因素對于菌絲體重量的影響不是簡單的線性關系。

2.1.5 因素間的交互作用

根據(jù)回歸方程并利用Design－Expert軟件作不同因素的響應面分析圖和等高線圖，溫度、pH值和轉速三因素及其交互作用對菌絲體重量的影響結果通過圖4～圖6直接反應出來。

結果表明，等高線的形狀可以反映出因素間交互效應的強弱，圓形表示兩因素間的交互效應不顯著，橢圓形表示顯著。

2.1.6 玫瑰紅鵝膏發(fā)酵條件的優(yōu)化與結果驗證

對方程Y=+1.00－0.018×A+0.020×B+0.018×C+0.052×A×B+5.500E－003×A×C+0.055×B×C－0.15×A2－0.16×B2－0.061×C2，最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度25℃、pH值6、轉速為156 r·min－1，其所得玫瑰紅鵝膏菌絲體干重為1.034 g。

2.1.7 回歸模型驗證試驗

根據(jù)最優(yōu)培養(yǎng)條件對模型進行驗證，3次平行驗證試驗所得玫瑰紅鵝膏菌絲體干重均值為1.054 g，優(yōu)化后提高了1.02倍，實際值與預測值的誤差為+2.8%。表明響應面法優(yōu)化玫瑰紅鵝膏最佳培養(yǎng)條件是有效可行的。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物中肽類毒素的檢測

將菌絲體粗提物液通過液相進行分離純化。液相保留時間，因不同的分離條件和不同的色譜柱，保留時間有一定的差異，但是各個化合物在液相上的出峰順序保持不變。同時根據(jù)液相色譜質譜聯(lián)用儀和內(nèi)標法確定化合物，得到2個化合物，但是其含量較低?；衔?在分析柱上檢測結果如圖7所示。

檢測化合物1保留時間是11.41 min，純度較高。電噴霧質譜[M+Na]峰是941，MW是918(圖8)。根據(jù)色譜保留時間和分子量，判斷組分為α－鵝膏毒肽 (α－AMA)，分子式為C39H54N10O14S。

化合物2在分析住上檢測結果如圖9所示，檢測化合物2保留時間是7.92 min。電噴霧質譜 [M－H]峰是918，MW是919(圖10)。根據(jù)色譜保留時間和分子量，判斷組分為β－鵝膏毒肽 (β－AMA)，分子式C39H53N9O15S。

2.3 對植物病原菌的抑制活性

2.3.1 玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液對香瓜枯萎病菌的抑制作用

玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液對香瓜枯萎病菌的抑制作用見表4。

表4 玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液對香瓜枯萎病菌抑制作用 (n=3)

由表4可以看出，鵝膏粗毒液對香瓜枯萎病菌的抑制作用呈量效關系。濃度為 200 μg·mL－1時抑制率最高，為42.47%，100 μg·mL－1時作用力次之，50 μg·mL－1時抑制率最低，且與空白組對比呈極顯著差異 (p＜0.01)。

2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌的抑制作用

發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌的抑制作用見表5。

表5 發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌的抑制作用 (n=3)

由表5可知，發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌的抑制作用呈量效關系。濃度為800 μg·mL－1時抑制率最高，為 21.29%;400 μg·mL－1時作用力次之，且與空白組對比呈極顯著差異(p ＜0.01);200 μg·mL－1時抑制率為 0。

3 討論

經(jīng)過響應面方法優(yōu)化，獲得了最佳培養(yǎng)條件，即溫度為25℃，pH值為6，轉數(shù)為156 r·min－1。此培養(yǎng)條件更適合玫瑰紅鵝膏菌絲體的生長。同時，在其發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到2種毒素α－AMA和β－AMA。但是毒素含量較低，如何提高發(fā)酵產(chǎn)物中的毒素含量有待于更進一步的研究。

玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液和發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌有不同的抑制作用。當子實體濃度為200 μg·mL－1時抑制率最高，為42.47%。可能是肽類毒素對植物病原菌有抑制作用，因為玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液和發(fā)酵產(chǎn)物中的肽類毒素的含量不同，造成了抑菌效果的差異。鵝膏肽類毒素影響真菌細胞內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ的活性，進而抑制了真菌細胞內(nèi)DNA和RNA的合成，繼而阻礙了蛋白質的合成，從而導致了細胞的死亡[14，15]。其作為新型的生物農(nóng)藥有待于更進一步的研究和應用。

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