楊 琳 樊子川 張 萍 吳冰冰 王慧君 周文浩

多發(fā)畸形(multiple congenital anomalies，MCA)是指某一個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)系統(tǒng)在出生時(shí)即發(fā)生的一種或多種形態(tài)或結(jié)構(gòu)上的異常，新生兒的發(fā)病率約為3%［1］。目前已經(jīng)識(shí)別診斷的MCA已達(dá)300余種。由于MCA表型存在明顯的異質(zhì)性，僅依靠臨床表型達(dá)到確診較為困難。

針對(duì)MCA遺傳學(xué)病因的分子遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展。大量研究表明，精神性疾病、神經(jīng)性疾病和先天性疾病等存在拷貝數(shù)變異(CNV)的異常。多重鏈接探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)是近年發(fā)展起來(lái)的一種針對(duì)待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的新技術(shù)［2］，屬于多重PCR技術(shù)，是一種檢測(cè)目的基因CNV的方法。荷蘭MRC-Holland公司應(yīng)用MLPA技術(shù)，對(duì)常見(jiàn)的一些MCA的探針?lè)謩e設(shè)置在了不同的試劑盒(P036、P064、P095、P245、P297 等)，在選擇上述不同試劑盒時(shí)需要對(duì)常見(jiàn)MCA的表型有很好認(rèn)知，但在中國(guó)具有分子遺傳學(xué)背景的臨床醫(yī)生還不多，臨床工作中面對(duì)MCA亟待針對(duì)性強(qiáng)的、涵蓋更大范圍疾病的和經(jīng)濟(jì)的分子水平生物學(xué)診斷技術(shù)。本研究根據(jù)13種常見(jiàn)的MCA的關(guān)鍵區(qū)域或關(guān)鍵基因，應(yīng)用MLPA探針設(shè)計(jì)流程設(shè)計(jì)合成新的MLPA探針組合，期望對(duì)常見(jiàn)的MCA有較高的陽(yáng)性診斷率，為臨床治療和遺傳咨詢提供幫助。

1 方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 檢驗(yàn)自行設(shè)計(jì)的MLPA探針組合診斷MCA的準(zhǔn)確性，以微陣列比較基因組雜交(array comparative genomichybridization，aCGH)作為金標(biāo)準(zhǔn);再以MLPA探針組合行MCA臨床診斷效果評(píng)估。本文對(duì)MCA的定義為臨床發(fā)現(xiàn)≥2個(gè)的畸形表型。

1.2 MCA病例來(lái)源 MLPA探針組合與金標(biāo)準(zhǔn)比較的病例:來(lái)源于我院新生兒出生缺陷生物樣本庫(kù)，存有提取了DNA的血標(biāo)本，人口學(xué)信息和臨床表型;臨床診斷效果評(píng)估病例:來(lái)源于2012年3月至2014年3月我院住院診斷為MCA的病例，取臨床檢驗(yàn)剩余的EDTA抗凝血提取全基因組DNA，并進(jìn)行MLPA檢測(cè)。MLPA探針組合用于MCA臨床診斷得到了我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 臨床信息采集 收集MLPA探針組合檢測(cè)陽(yáng)性患兒臨床資料，采集人口學(xué)信息:性別、胎齡、出生體重、母孕年齡、家族史等。臨床表型:特殊面容、肌張力、新生兒聽(tīng)力篩查、B超、超聲心動(dòng)圖和頭顱MRI/CT等影像學(xué)表現(xiàn)。

1.4 MLPA探針設(shè)計(jì)及合成

1.4.1 MCA及其關(guān)鍵基因的選擇 參考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/GeneTests/Review?db=GeneTests中常見(jiàn)MCA的描述，選擇發(fā)病率相對(duì)較高、病因主要為染色體部分重復(fù)/缺失的綜合征。并根據(jù)該描述及已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇關(guān)鍵基因或關(guān)鍵區(qū)域。若尚未明確關(guān)鍵基因或關(guān)鍵區(qū)域，選擇重復(fù)/缺失片段兩端各一及中間位置的3個(gè)基因，以代表該區(qū)段。

1.4.2 探針序列的設(shè)計(jì) 選擇的目的基因序列在http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat中獲得，并區(qū)別標(biāo)記編碼區(qū)、SNP及重復(fù)序列。針對(duì)每個(gè)目的基因，探針均由左半序列和右半序列組成，左半序列5'端至3'端依次為:左通用引物序列和左半探針序列;右半序列5'端至3'端依次為:磷酸標(biāo)記、右半探針序列和右通用引物序列。左、右探針序列與目的基因的目的序列相同，并可在連接酶的作用下直接相連。左、右序列滿足如下條件:①序列長(zhǎng)度唯一性;②GC含量在50%左右;③Tm值≥70℃;④在連接位點(diǎn)不含SNP;⑤無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu);⑥在人類基因組內(nèi)無(wú)相同重復(fù)序列。序列GC含量、Tm值檢測(cè)采用Raw Probe軟件;二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)在線(http://mfold.rna.albany.edu)進(jìn)行;在線(http://genome.uscs.edu/cgi-bin/hgBlat)檢測(cè)人類基因組內(nèi)是否為特異性序列。

1.5 MLPA探針組合序列的合成 設(shè)計(jì)好的序列，送SIGMA公司合成(鑒于MLPA探針序列和實(shí)驗(yàn)流程占用較多版面，如有需要可與本文通訊作者聯(lián)系索取)。

1.6 MLPA探針組合檢測(cè)及異常判斷標(biāo)準(zhǔn) 按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行MLPA實(shí)驗(yàn)，采用Genemarker Demo 1.97版本軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。MLPA數(shù)據(jù)結(jié)果顯示相對(duì)峰高度比＜0.75或者 ＞1.25認(rèn)為是異常結(jié)果［3］。

2 結(jié)果

2.1 MCA及其關(guān)鍵區(qū)域或關(guān)鍵基因選擇結(jié)果 共13種常見(jiàn)的 MCA:21-三體綜合征(KCNJ6、DYRK1A、RCAN1 基因)，18-三體綜合征(MC2R、DTNA、TCF4 基因)，13-三體綜合征(EDNRB、CENPJ、ERCC5、FREM2 基因)，1p36 區(qū)域缺失綜合征(GABRD、SKI、TP73基因)，5q35.3區(qū)域缺失綜合征(Sotos綜合征，NSD1基因)，CHARGE綜合征(CHD7基因)，7q11.23區(qū)域缺失綜合征(Williams Beuren綜合征，CLIP2、ELN、LIMK1 基因)，22q11.21 區(qū)域缺失、重復(fù)綜合征(DiGeorge綜合征，SNAP29、TBX1、ZNF74 基因)，17p11 區(qū)域缺失綜合征(Smith-Magenis綜合征，RAI1、MFAP4基因)，5p15.2區(qū)域缺失綜合征(Cridu Chat綜合征，CTNND2、TERT基因)，15q11-13區(qū)域缺失綜合征(Prader-Willi綜合征，OCA2、UBE3A、GABRB3 基因)，4p16.3 區(qū)域缺失綜合征(Wolf Hirschhorn 綜合征，MSX1、WHSC1、LETM1 基因)，17q21.31區(qū)域缺失綜合征(MAP3K14、MAPT基因)。

2.2 aCGH和MLPA探針組合檢測(cè)結(jié)果 來(lái)自于我院新生兒出生缺陷樣本庫(kù)的35例MCA中，aCGH檢測(cè)陰性24例，陽(yáng)性11例(31.4%)，共診斷9種;MLPA探針組合檢測(cè)陰性29例，陽(yáng)性6例(17.1%)，共診斷4種;MLPA組合探針檢測(cè)陽(yáng)性的6例微缺失和重復(fù)與11例aCGH檢測(cè)陽(yáng)性一致，6例MLPA探針組合檢測(cè)陽(yáng)性的變異位點(diǎn)均位于MLPA探針組合設(shè)計(jì)中，MLPA探針組合檢測(cè)陰性的5例變異位點(diǎn)均不在MLPA探針組合設(shè)計(jì)中。來(lái)自于我院住院診斷為MCA的122例患兒中，MLPA探針組合檢測(cè)陰性101例，陽(yáng)性21例(17.2%)，診斷6種。

2.2 MCA病例診斷結(jié)果 本文以MLPA探針組合共檢測(cè)157例MCA患兒，做出遺傳學(xué)病因診斷27例;MLPA探針組合共檢出7/13種(53.8%)，分別為21-三體綜合征8例，18-三體綜合征1例，15q11-q13區(qū)域缺失綜合征3例，5p15區(qū)域缺失綜合征3例，22q11區(qū)域重復(fù)綜合征1例和22q11區(qū)域缺失綜合征9例，7q11.23區(qū)域微缺失綜合征1例，5q35區(qū)域缺失綜合征1例。部分 MLPA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1A～G。

2.3 MLPA探針組合檢測(cè)陽(yáng)性病例一般情況 表1顯示27例MLPA探針組合檢測(cè)陽(yáng)性患兒的臨床信息，男性18例，女性9例。8例21-三體綜合征患兒(例1～8)，男性6例、女性2例，胎齡信息缺如，出生體重(2 918±1 051)g，母孕年齡(34.8±5.4)歲;3例 Prader-Willi綜合征患兒(例10～12)，男性2例、女性1例，平均胎齡不詳，出生體重(2 167±638)g，母孕年齡(27.0±8.2)歲，例11家族史中第一胎有面部畸形、通貫手、腦發(fā)育異常和多囊腎表型，并于出院后3d死亡;10例 DiGeorge綜合征患兒(例13～22)，男性6例、女性4例，胎齡不詳、5例出生體重、母孕年齡不詳;3例貓叫綜合征患兒(例23～25)，均為男性，胎齡不詳，出生體重(2 728±949)g，母孕年齡(32.0±3.6)歲，例23的祖父母為表兄妹近親結(jié)婚，其有一伯父智力低下。

3 討論

CNVs檢測(cè)的技術(shù)方法較多，如熒光定量PCR、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、MLPA和以微陣列平臺(tái)為基礎(chǔ)的全基因組分析技術(shù)［4，5］。全基因組微陣列分析技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)約99%的染色體結(jié)構(gòu)畸變，有報(bào)道將其推薦為首選的MCA的篩查檢測(cè)手段，但是其昂貴的檢測(cè)價(jià)格限制了其在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用［6～8］。FISH的價(jià)格相對(duì)便宜，臨床檢驗(yàn)效率較高［9］，但是對(duì)染色體亞端粒失衡和微缺失的檢測(cè)還存在一定的局限性。MLPA技術(shù)克服了熒光定量PCR檢測(cè)能力不足的缺點(diǎn)，一次能夠分析40～45個(gè)序列，并具有更高的分辨率、靈敏度和可重復(fù)性。同時(shí)，MLPA較微陣列平臺(tái)的檢測(cè)方法，更加經(jīng)濟(jì)、快捷，針對(duì)性更強(qiáng)，更適合作為臨床的常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行推廣應(yīng)用

表1 27例 MLPA 陽(yáng)性患兒詳細(xì)臨床信息Tab1 Clinical manifestayions and MLPA positive results of 27 patients

本研究以aCGH為金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)了自行設(shè)計(jì)MLPA探針組合對(duì)MCA診斷和應(yīng)用價(jià)值。35例MCA aCGH共診斷9種，包括MLPA探針組合檢測(cè)陽(yáng)性的4種;aCGH共診斷了11例MCA，包括MLPA探針組合診斷的6例MCA;6例MLPA探針組合檢測(cè)陽(yáng)性的變異位點(diǎn)均位于MLPA探針組合設(shè)計(jì)中，而5例檢測(cè)陰性的變異位點(diǎn)均不在MLPA探針組合設(shè)計(jì)中。檢驗(yàn)自行設(shè)計(jì)的MLPA探針組合診斷的準(zhǔn)確性，最好是能取得更多的MCA樣本，并且包括設(shè)計(jì)的全部病種，本文作為與aCGH金標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)的MCA病例僅為35例，也僅所包括設(shè)計(jì)的4個(gè)病種，雖然MLPA探針組合檢出的微缺失和重復(fù)與aCGH金標(biāo)準(zhǔn)相同，但仍有較大的缺憾。35例MCA檢測(cè)陽(yáng)性率17.1%，122例我院住院診斷為MCA中，MLPA探針組合檢測(cè)陽(yáng)性17.2%，說(shuō)明MLPA探針組合在與金標(biāo)準(zhǔn)比較的樣本和臨床診斷效果評(píng)估的樣本中都取得一致的診斷率，而且隨著樣本量的增加，又多檢出了3種，仍然沒(méi)有完全包括涵蓋的全部MCA，MLPA探針組合尚有6種MCA沒(méi)有被檢出，與本文檢測(cè)的MCA病例數(shù)少有關(guān)。有些檢驗(yàn)陽(yáng)性患兒的非典型臨床發(fā)現(xiàn)可能與臨床表型異質(zhì)性相關(guān)，也可能與臨床表型發(fā)現(xiàn)不完整有關(guān)。與荷蘭MRC-Holland公司的商業(yè)化試劑盒相比，本研究涉及的13種MCA雖然與其有部分重疊，但是本MLPA探針組合整合了13種常見(jiàn)的病因主要為染色體部分重復(fù)/缺失的綜合征的探針，相比起來(lái)更加簡(jiǎn)便，更適合沒(méi)有深刻遺傳學(xué)背景的臨床醫(yī)生對(duì)MCA的遺傳咨詢和診斷需要。

臨床實(shí)踐中，有多種MCA的首要臨床表現(xiàn)相似，而且有些患兒的臨床表現(xiàn)不典型，很難及早做出臨床診斷，通過(guò)分子檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)這些臨床表現(xiàn)相似的綜合征進(jìn)行鑒別診斷。例如，Prader-Willi綜合征患兒，其新生兒期典型的臨床表現(xiàn)為肌張力低下和喂養(yǎng)困難，特異性較差，與一些其他綜合征有相似的臨床表現(xiàn)，臨床上較難進(jìn)行鑒別診斷，表1中例11主要臨床表現(xiàn)為新生兒期肌張力低下、隱睪、小陰囊，表1中例10和12臨床表現(xiàn)不典型，僅通過(guò)臨床表型，很難做出臨床診斷，對(duì)患兒的預(yù)后影響很大。DiGeorge綜合征是22q11微缺失綜合征中最常見(jiàn)的一種，屬于原發(fā)性細(xì)胞免疫缺陷病，其臨床表現(xiàn)主要為先天性心臟病、腭發(fā)育不良、低血鈣、免疫缺陷和特殊面容［10］?；純和ǔ：喜⒂忻庖呷毕荩瑢?duì)先天性心臟病的患兒進(jìn)行篩查可以早期明確診斷，給予患兒相應(yīng)的治療，提高患兒的生存質(zhì)量。表1中例13僅表現(xiàn)為耳前贅生物、喉璞、左腎腎盂輕度增寬，這些表型都可以在22q11缺失綜合征中出現(xiàn)［11，12］，但僅憑這些非典型的臨床表現(xiàn)很難做出臨床診斷。此外本研究還檢出1例22q11微重復(fù)綜合征，本病通過(guò)常規(guī)的染色體G顯帶技術(shù)很難發(fā)現(xiàn)22q11區(qū)域的微重復(fù)，大多數(shù)22q11微重復(fù)綜合征都是通過(guò)MLPA探針檢出的［13］。

綜上，本研究通過(guò)自行設(shè)計(jì)的MLPA探針組合，對(duì)臨床發(fā)現(xiàn)為MCA的患兒進(jìn)行了遺傳學(xué)病因診斷，取得了較高的診斷率，在分子水平上對(duì)一些常見(jiàn)的MCA和臨床表現(xiàn)不典型的或者有相似臨床表型的患兒明確了遺傳學(xué)病因，相比其他的檢測(cè)手段，MLPA技術(shù)快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便，在臨床檢驗(yàn)方面有一定的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)患兒的臨床治療、預(yù)后和家庭遺傳咨詢有一定的指導(dǎo)作用。

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