珍珠菜組培快繁體系研究

寧夢雅等

摘要：以珍珠菜種子為材料進(jìn)行消毒及無菌苗培養(yǎng)，再以消毒后萌發(fā)的無菌苗的葉片、莖段和帶葉腋莖為外植體，開展叢生芽的誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和移栽馴化技術(shù)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，珍珠菜種子最佳消毒方式為5%次氯酸鈉消毒10 min，最適叢生芽誘導(dǎo)部位為葉片，叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；其次為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L。最適珍珠菜增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L，其次為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 2.0 mg/L。最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L，其次為1/2MS+NAA 1.0 mg/L。最適珍珠菜移栽馴化的方法為開瓶馴化5 d后種植于蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭（1 ∶1 ∶1）基質(zhì)中。本研究結(jié)果為利用組織培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)珍珠菜快速繁殖和人工擴(kuò)大栽培奠定了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：珍珠菜；組織培養(yǎng)；叢生芽誘導(dǎo)；增殖培養(yǎng)；生根培養(yǎng)；移栽馴化

中圖分類號： Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0045-04

收稿日期：2013-12-17

作者簡介：寧夢雅，女，河北永清人，碩士研究生，從事珍珠菜組織培養(yǎng)技術(shù)研究。E-mail：ningmengya@126.com。

通信作者：林夏珍，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事園林植物栽培與管理研究。E-mail：linxz100@sohu.com。珍珠菜（Lysimachia clethroides）為報春花科珍珠菜屬珍珠菜亞屬植物，別稱矮桃、珍珠草（湖南），調(diào)經(jīng)草、尾脊草（貴州），剦雞尾、勞傷藥、伸筋散、九節(jié)蓮（云南），產(chǎn)于浙江省各地。生于山坡林緣和草叢中等濕潤處，垂直分布上限可達(dá)海拔 2 500 m。華東、華中、華南、西南、華北及東北均有分布[1-2]。珍珠菜為長日照植物，需低溫處理打破根莖休眠，總狀花序頂生、常轉(zhuǎn)向一側(cè)，可作為切花應(yīng)用，也是良好的夏季草本地被花卉資源[3-4]。珍珠菜的生物學(xué)特性、化學(xué)成分和藥用的研究也多見報道。珍珠菜的組織培養(yǎng)研究不僅可以滿足化學(xué)成分和藥用的需要，豐富園林地被植物種類，滿足園林綠化快速成型的要求，還可為珍珠菜的分子育種奠定基礎(chǔ)[5]。本試驗研究了種子消毒、芽誘導(dǎo)與增殖生根等培養(yǎng)條件，建立了珍珠菜完整的植株再生體系，大大縮短了培養(yǎng)時間、提高了增殖系數(shù)、降低了成本，為珍珠菜規(guī)模化生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)[6]。

1材料與方法

1.1材料

材料為采自浙江省杭州市臨安市清涼峰珍珠菜當(dāng)年生種子，通風(fēng)干燥后4 ℃冰箱內(nèi)冷藏。無菌葉片、莖段和帶葉腋莖均取自種子萌發(fā)出的無菌苗。

1.2方法

1.2.1種子消毒挑選顆粒飽滿無病蟲害的種子，紗布包裹流水沖洗2 h后，置于超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡并振蕩30 s，并用無菌水沖洗3次后，用5%次氯酸鈉和2%次氯酸鈉各浸泡振蕩5、10、15、20 min，每次消毒后均用無菌水沖洗3次。將消毒處理后的種子接種于MS空白培養(yǎng)基上，消毒處理20粒種子，3次重復(fù)試驗。30 d后統(tǒng)計污染率和萌發(fā)率。

1.2.2叢生芽誘導(dǎo)將種子萌發(fā)的無菌苗葉片、莖段和帶葉腋莖剪成5 mm×5 mm左右小塊，接種于6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）、KT（2.0、3.0、4.0 mg/L）和NAA（0.05、0.1、0.5 mg/L）的2因素3水平完全試驗培養(yǎng)基中，分別為C1（6-BA+NAA）、C2（KT+NAA）組合。每處理20個材料，3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)系數(shù)。

1.2.3叢生芽增殖誘導(dǎo)出的叢生芽小苗長到2～3 cm后切成單芽并轉(zhuǎn)接到添加了6-BA（0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L）和KT（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L）的單因素培養(yǎng)基，以及6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）、KT（2.0、3.0、4.0 mg/L）和NAA（0.05、0.1、0.5 mg/L）的2因素3水平完全試驗培養(yǎng)基中。每處理20個材料，3次重復(fù)。30 d后觀察并統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.4生根培養(yǎng)叢生芽長到2～3 cm高時切成單芽轉(zhuǎn)接到添加0.1、0.5、1.0 、2.0、3.0 mg/L NAA、IBA的1/2MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對照為1/2MS空白培養(yǎng)基。每處理20個材料，3次重復(fù)。40 d后觀察并統(tǒng)計生根率、平均根數(shù)和根長。

1.2.5移栽馴化參照文獻(xiàn)[7]的方法，在9—10月，將生根的組培苗放在自然光下封口煉苗3 d，再打開瓶蓋分別煉苗0、1、3、5、7 d。然后移栽至蛭石：珍珠巖：泥炭（1 ∶1 ∶1）基質(zhì)中，研究不同煉苗時間對珍珠菜組培苗移栽成活的影響。將在自然光條件下煉苗3 d后、打開瓶蓋煉苗 5 d 的組培苗移栽至以下5種基質(zhì)中：（1）珍珠巖 ∶蛭石（1 ∶1），（2）泥炭，（3）蛭石 ∶泥炭（1 ∶1），（4）珍珠巖 ∶泥炭（1 ∶1），（5）蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭（1 ∶1 ∶1），研究不同基質(zhì)對珍珠菜試管苗移栽成活的影響。每處理均套袋保持濕度，7 d后除去。每處理20個材料，3次重復(fù)，30 d后統(tǒng)計成活率。

1.3培養(yǎng)條件

除特殊說明外，基本培養(yǎng)基為MS，培養(yǎng)基中添加蔗糖 30 g/L、瓊脂7.0 g/L，pH值5.8。溫度（25±2） ℃，光照時間12 h/d，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx。

1.4數(shù)據(jù)采集與分析方法

數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計采用Excel 2003；采用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。污染率=污染種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出叢生芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%；誘導(dǎo)系數(shù)=誘導(dǎo)出的叢生芽數(shù)/外植體總數(shù)×100%；增殖系數(shù)=產(chǎn)生的新苗數(shù)/接種苗數(shù)，有效芽長>0.5 cm；生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%；平均根數(shù)（條）=總根數(shù)/生根苗數(shù)；平均根長（cm）=總根長度/總根數(shù)；成活率=移栽成活苗數(shù)/移栽苗總數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方式對珍珠菜種子萌發(fā)率與污染率的影響

消毒后的種子接種于MS空白培養(yǎng)基上1 d后開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象，15 d后不再有污染現(xiàn)象出現(xiàn)。種子接種9 d開始萌發(fā)，萌發(fā)時間主要集中在接種后的9～18 d。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計的污染率和萌發(fā)率見表1，可以看出，不同消毒處理之間差異顯著，污染率隨著消毒時間的增長而下降，而種子萌發(fā)率則呈先上升后下降的趨勢。5%次氯酸鈉消毒 10 min 時，污染率為7.50%，萌發(fā)率為15.0%，消毒效果最好。

2.2不同激素組合對叢生芽誘導(dǎo)的影響

將無菌材料接種到培養(yǎng)基上，接種7 d后大部分葉片反卷，切口處膨大增厚，10 d開始在葉片切口處產(chǎn)生大量芽點，后逐漸發(fā)育成叢生芽。大部分莖段在接種10 d左右開始膨大，切口處生有少量芽點后形成叢生芽，少量莖段上產(chǎn)生綠色顆粒狀組織，但無進(jìn)一步分化。大部分帶葉腋莖接種后6 d在葉腋處長出嫩芽，后逐漸長成苗，切口處也會產(chǎn)生少量叢

表1不同消毒方式下珍珠菜種子的污染率和萌發(fā)率統(tǒng)計

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

珍珠菜種子最佳消毒方式為5%次氯酸鈉消毒10 min，最適叢生芽誘導(dǎo)的部位為葉片，叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基，其次為添加6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基。最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L，其次為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基。最適生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L，其次為1/2MS+NAA 1.0 mg/L。珍珠菜移栽馴化的方法為幼苗在自然光照射下培養(yǎng)3 d后再開瓶馴化5 d，最后種植于蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭（1 ∶1 ∶1）基質(zhì)中。

3.2討論

試驗中雖得出了種子的最佳消毒方法，但種子萌發(fā)率很低，這可能是因為珍珠菜種子較小，種皮較薄，在消毒劑浸泡過程中傷害到了種胚，致使種子不能萌發(fā)死亡，以后的試驗可

以探索較溫和的消毒方法。由于同一植物的不同組織和器官，其再生能力有很大差距，并非所有的部位都能順利分化出芽。因此，在組織培養(yǎng)試驗中選擇合適的外植體類型是試驗成功的重要條件之一，而培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件也在組織培養(yǎng)過程中起重要作用[8-9]。本試驗選擇珍珠菜的葉片、莖段和帶葉腋莖為外植體，且結(jié)果為葉片為誘導(dǎo)叢生芽最佳外植體。在誘導(dǎo)叢生芽過程中，細(xì)胞分裂素與生長素組合有利于叢生芽的生成，其中細(xì)胞分裂素的濃度增高誘導(dǎo)效果隨之增高，且6-BA效果明顯好于KT，而細(xì)胞分裂素或生長素兩兩組合不利于叢生芽誘導(dǎo)。珍珠菜的增殖過程中，細(xì)胞分裂素和生長素的組合效果比細(xì)胞分裂素組合效果差。在移栽馴化過程中，0 d開瓶時間由于植株還沒有由異養(yǎng)轉(zhuǎn)成自養(yǎng)模式，無法從基質(zhì)中吸取營養(yǎng)與水分，所以移栽后植株易死亡，成活率低。而開瓶7 d后，可能基質(zhì)污染影響到根系，造成植株死亡，成活率降低。在基質(zhì)組合中，蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭（1 ∶1 ∶1）透氣透水性最好，最利于植株生長，而泥炭基質(zhì)透氣性差，水分不易流失導(dǎo)致根部腐爛，植株死亡。本試驗成功地建立了珍珠菜組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)體系，對快速繁殖珍珠菜優(yōu)良品種和種質(zhì)資源的離體保存具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳封懷，胡啟明.中國植物志：第59卷第1冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，1989：102-103.

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[8]陳雪鵑，吳玨，李雪珂，等. 芙蓉菊組培快繁技術(shù)的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2012，32（7）：100-104，127.

[9]全妙華，歐立軍，賀安娜，等. 天門冬組培快繁技術(shù)研究[J]. 中草藥，2012，43（8）：1599-1603.

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方式對珍珠菜種子萌發(fā)率與污染率的影響

消毒后的種子接種于MS空白培養(yǎng)基上1 d后開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象，15 d后不再有污染現(xiàn)象出現(xiàn)。種子接種9 d開始萌發(fā)，萌發(fā)時間主要集中在接種后的9～18 d。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計的污染率和萌發(fā)率見表1，可以看出，不同消毒處理之間差異顯著，污染率隨著消毒時間的增長而下降，而種子萌發(fā)率則呈先上升后下降的趨勢。5%次氯酸鈉消毒 10 min 時，污染率為7.50%，萌發(fā)率為15.0%，消毒效果最好。

2.2不同激素組合對叢生芽誘導(dǎo)的影響

將無菌材料接種到培養(yǎng)基上，接種7 d后大部分葉片反卷，切口處膨大增厚，10 d開始在葉片切口處產(chǎn)生大量芽點，后逐漸發(fā)育成叢生芽。大部分莖段在接種10 d左右開始膨大，切口處生有少量芽點后形成叢生芽，少量莖段上產(chǎn)生綠色顆粒狀組織，但無進(jìn)一步分化。大部分帶葉腋莖接種后6 d在葉腋處長出嫩芽，后逐漸長成苗，切口處也會產(chǎn)生少量叢

表1不同消毒方式下珍珠菜種子的污染率和萌發(fā)率統(tǒng)計

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

珍珠菜種子最佳消毒方式為5%次氯酸鈉消毒10 min，最適叢生芽誘導(dǎo)的部位為葉片，叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基，其次為添加6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基。最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L，其次為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基。最適生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L，其次為1/2MS+NAA 1.0 mg/L。珍珠菜移栽馴化的方法為幼苗在自然光照射下培養(yǎng)3 d后再開瓶馴化5 d，最后種植于蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭（1 ∶1 ∶1）基質(zhì)中。

3.2討論

試驗中雖得出了種子的最佳消毒方法，但種子萌發(fā)率很低，這可能是因為珍珠菜種子較小，種皮較薄，在消毒劑浸泡過程中傷害到了種胚，致使種子不能萌發(fā)死亡，以后的試驗可

以探索較溫和的消毒方法。由于同一植物的不同組織和器官，其再生能力有很大差距，并非所有的部位都能順利分化出芽。因此，在組織培養(yǎng)試驗中選擇合適的外植體類型是試驗成功的重要條件之一，而培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件也在組織培養(yǎng)過程中起重要作用[8-9]。本試驗選擇珍珠菜的葉片、莖段和帶葉腋莖為外植體，且結(jié)果為葉片為誘導(dǎo)叢生芽最佳外植體。在誘導(dǎo)叢生芽過程中，細(xì)胞分裂素與生長素組合有利于叢生芽的生成，其中細(xì)胞分裂素的濃度增高誘導(dǎo)效果隨之增高，且6-BA效果明顯好于KT，而細(xì)胞分裂素或生長素兩兩組合不利于叢生芽誘導(dǎo)。珍珠菜的增殖過程中，細(xì)胞分裂素和生長素的組合效果比細(xì)胞分裂素組合效果差。在移栽馴化過程中，0 d開瓶時間由于植株還沒有由異養(yǎng)轉(zhuǎn)成自養(yǎng)模式，無法從基質(zhì)中吸取營養(yǎng)與水分，所以移栽后植株易死亡，成活率低。而開瓶7 d后，可能基質(zhì)污染影響到根系，造成植株死亡，成活率降低。在基質(zhì)組合中，蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭（1 ∶1 ∶1）透氣透水性最好，最利于植株生長，而泥炭基質(zhì)透氣性差，水分不易流失導(dǎo)致根部腐爛，植株死亡。本試驗成功地建立了珍珠菜組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)體系，對快速繁殖珍珠菜優(yōu)良品種和種質(zhì)資源的離體保存具有重要意義。

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[8]陳雪鵑，吳玨，李雪珂，等. 芙蓉菊組培快繁技術(shù)的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2012，32（7）：100-104，127.

[9]全妙華，歐立軍，賀安娜，等. 天門冬組培快繁技術(shù)研究[J]. 中草藥，2012，43（8）：1599-1603.

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方式對珍珠菜種子萌發(fā)率與污染率的影響

消毒后的種子接種于MS空白培養(yǎng)基上1 d后開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象，15 d后不再有污染現(xiàn)象出現(xiàn)。種子接種9 d開始萌發(fā)，萌發(fā)時間主要集中在接種后的9～18 d。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計的污染率和萌發(fā)率見表1，可以看出，不同消毒處理之間差異顯著，污染率隨著消毒時間的增長而下降，而種子萌發(fā)率則呈先上升后下降的趨勢。5%次氯酸鈉消毒 10 min 時，污染率為7.50%，萌發(fā)率為15.0%，消毒效果最好。

2.2不同激素組合對叢生芽誘導(dǎo)的影響

將無菌材料接種到培養(yǎng)基上，接種7 d后大部分葉片反卷，切口處膨大增厚，10 d開始在葉片切口處產(chǎn)生大量芽點，后逐漸發(fā)育成叢生芽。大部分莖段在接種10 d左右開始膨大，切口處生有少量芽點后形成叢生芽，少量莖段上產(chǎn)生綠色顆粒狀組織，但無進(jìn)一步分化。大部分帶葉腋莖接種后6 d在葉腋處長出嫩芽，后逐漸長成苗，切口處也會產(chǎn)生少量叢

表1不同消毒方式下珍珠菜種子的污染率和萌發(fā)率統(tǒng)計

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

珍珠菜種子最佳消毒方式為5%次氯酸鈉消毒10 min，最適叢生芽誘導(dǎo)的部位為葉片，叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基，其次為添加6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基。最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L，其次為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基。最適生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L，其次為1/2MS+NAA 1.0 mg/L。珍珠菜移栽馴化的方法為幼苗在自然光照射下培養(yǎng)3 d后再開瓶馴化5 d，最后種植于蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭（1 ∶1 ∶1）基質(zhì)中。

3.2討論

試驗中雖得出了種子的最佳消毒方法，但種子萌發(fā)率很低，這可能是因為珍珠菜種子較小，種皮較薄，在消毒劑浸泡過程中傷害到了種胚，致使種子不能萌發(fā)死亡，以后的試驗可

以探索較溫和的消毒方法。由于同一植物的不同組織和器官，其再生能力有很大差距，并非所有的部位都能順利分化出芽。因此，在組織培養(yǎng)試驗中選擇合適的外植體類型是試驗成功的重要條件之一，而培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件也在組織培養(yǎng)過程中起重要作用[8-9]。本試驗選擇珍珠菜的葉片、莖段和帶葉腋莖為外植體，且結(jié)果為葉片為誘導(dǎo)叢生芽最佳外植體。在誘導(dǎo)叢生芽過程中，細(xì)胞分裂素與生長素組合有利于叢生芽的生成，其中細(xì)胞分裂素的濃度增高誘導(dǎo)效果隨之增高，且6-BA效果明顯好于KT，而細(xì)胞分裂素或生長素兩兩組合不利于叢生芽誘導(dǎo)。珍珠菜的增殖過程中，細(xì)胞分裂素和生長素的組合效果比細(xì)胞分裂素組合效果差。在移栽馴化過程中，0 d開瓶時間由于植株還沒有由異養(yǎng)轉(zhuǎn)成自養(yǎng)模式，無法從基質(zhì)中吸取營養(yǎng)與水分，所以移栽后植株易死亡，成活率低。而開瓶7 d后，可能基質(zhì)污染影響到根系，造成植株死亡，成活率降低。在基質(zhì)組合中，蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭（1 ∶1 ∶1）透氣透水性最好，最利于植株生長，而泥炭基質(zhì)透氣性差，水分不易流失導(dǎo)致根部腐爛，植株死亡。本試驗成功地建立了珍珠菜組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)體系，對快速繁殖珍珠菜優(yōu)良品種和種質(zhì)資源的離體保存具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

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