1株飼用木聚糖酶產(chǎn)生菌的分離、鑒定、發(fā)酵、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用

郄衛(wèi)那等

摘要：以木聚糖為唯一碳源，從長期堆放枯枝敗葉的土壤中篩選能夠高效降解木聚糖的菌株，并對(duì)該菌的產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。分離得到1株酶活性較高且產(chǎn)酶相對(duì)穩(wěn)定的菌株，鑒定為尖孢鐮刀菌，命名為Fusarium oxysporum MJ23。研究表明，木聚糖、酵母粉是該菌的最適培養(yǎng)底物，在最適培養(yǎng)條件下，該菌株所產(chǎn)木聚糖酶活力可達(dá)186 U/mL；木聚糖酶的最適作用溫度、pH值分別為55 ℃、6，55 ℃保溫3 h，EDTA、尿素和SDS則會(huì)抑制酶活，其中SDS的抑制作用最強(qiáng)。模擬動(dòng)物體內(nèi)對(duì)飼料中半纖維素組分的消化，木聚糖酶的添加可使豬飼料中木糖生成量提高28%，雞飼料中木糖生成量提高16%，表明該菌株所產(chǎn)木聚糖酶具有用作飼料添加劑的可能性。

關(guān)鍵詞：木聚糖酶；酶學(xué)性質(zhì)；產(chǎn)酶條件；飼料；尖孢鐮刀菌

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0196-04

收稿日期：2013-12-07

作者簡介：郄衛(wèi)那（1986—），女，河北石家莊人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物與環(huán)境工程。E-mail：woniubeibao@gmail.com。

通信作者：賀芹，山東棗莊人，講師，主要研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：qhe@njau.edu.cn。我國作為重要的農(nóng)業(yè)大國，所產(chǎn)玉米、小麥、大麥、高粱等主糧以及由此形成的諸如麩子、秸稈、稻殼等農(nóng)副產(chǎn)品是家畜植物性飼料的主要來源，但其中所含的木聚糖等非淀粉多糖成分不能被非反芻動(dòng)物利用。這主要是因?yàn)閱挝竸?dòng)物消化道內(nèi)缺乏植酸酶、纖維素酶和非淀粉多糖酶等相關(guān)酶；并且植物性飼料中存在的β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖等物質(zhì)會(huì)增加食糜黏度，同時(shí)影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收降解，從而降低飼料的利用率。木聚糖酶的添加可降解飼料中的木聚糖成分，提高動(dòng)物對(duì)木聚糖等物質(zhì)的利用率，而且生成的木糖等小分子物質(zhì)減輕了腸胃負(fù)擔(dān)，促進(jìn)了機(jī)體對(duì)食物的消化及對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；同時(shí)，飼料利用率的提高可以減少飼料的投喂量，提高料肉比，降低成本，進(jìn)而提高經(jīng)濟(jì)效益。木聚糖酶具有廣泛的微生物來源，包括各種真菌、放線菌、細(xì)菌等，其中較為重要的產(chǎn)木聚糖酶的微生物包括曲霉（Aspergilli）、青霉（Penicillium）、鐮刀菌（Fusarium）、芽孢桿菌（Bacillus）等[1-2]。目前，國際上的相關(guān)研究主要集中在木聚糖酶的發(fā)酵誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)機(jī)理、酶基因分子的克隆與表達(dá)、酶的純化鑒定等方面；國內(nèi)則側(cè)重于產(chǎn)木聚糖酶菌株篩選與馴化、工程菌構(gòu)建、培養(yǎng)條件優(yōu)化、酶學(xué)性質(zhì)以及酶的純化等方面[3]。本研究從長期堆放枯枝敗葉、作物秸稈的土壤中篩選出1株酶活性較高且產(chǎn)酶相對(duì)穩(wěn)定的菌株，經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），并對(duì)該菌株的酶學(xué)性質(zhì)及發(fā)酵條件等進(jìn)行探討，以期為微生物木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土樣采集自江西省南康市長期堆放秸稈、枯枝落葉以及施用過漚肥的土壤。

1.2儀器與試劑

Himac CR-21GⅡ高速冷凍離心機(jī)，Hitachi公司；722光柵分光光度計(jì)，上海分析儀器總廠；PCR擴(kuò)增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

真菌提取DNA試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；木聚糖，購自Sigma公司；D-木糖、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、酒石酸鉀鈉等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麩皮、玉米芯、豆粕、菜籽粕、棉粕、魚粉，市售；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3培養(yǎng)基

平板初篩培養(yǎng)基：1%木聚糖，0.2% NaNO3，0.2% KH2PO4，0.1% K2HPO4，0.05% NaCl，0.05% MgSO4·7H2O，2%瓊脂，pH值自然條件；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：1%木聚糖，0.5%葡萄糖，1%酵母粉，0.2% （NH4）2SO4，0.5%KH2PO4，0.1%MgSO4·7H2O，0.05%NaCl，pH值自然條件；其他為PDA培養(yǎng)基（配方略）。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1菌株的分離純化取1 mL土樣富集液，進(jìn)行梯度稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h。挑選透明圈較大的單菌落，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中反復(fù)純化。將純化后的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，測(cè)酶活，重復(fù)測(cè)定3～5次后確定產(chǎn)酶最高的菌株，記為MJ-23，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2菌絲體制備及DNA提取從平板上挑取直徑0.6 cm菌苔，加入PDA液體培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min培養(yǎng)48 h。紗布過濾得菌絲體，清洗、擠壓、晾干后放入研缽中，加適量液氮研磨至粉末狀，再裝入1.5 mL離心管中。DNA提取采用試劑盒法，加入400 μL裂解液和4 μL β-巰基乙醇，震蕩混勻后，于65 ℃水浴1 h至細(xì)胞完全裂解；加入200 μL buffer PF（市購），充分混勻，于-20 ℃冰箱放置5 min后，室溫、10 000 r/min 條件離心5 min；取上清，加入等體積異丙醇后于室溫、10 000 r/min離心5 min，棄上清；在沉淀中加入1 mL 75%乙醇洗滌2次，10 000 r/min離心2 min；將獲得的DNA用50～100 μL去離子水溶解，4 ℃溶解過夜，-20 ℃凍存。

1.4.3菌株rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育地位的確定以菌株MJ-23的DNA作為模板，利用真菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。其中正向引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。50 μL擴(kuò)增體系參照文獻(xiàn)[4]。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的已有序列進(jìn)行Blast分析比對(duì)，構(gòu)建供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹[5]。

1.4.4木聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)及酶活力的測(cè)定從固體培養(yǎng)基上挑取直徑0.6 cm的菌苔加入裝有50 mL發(fā)酵液體的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、170 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h；再將發(fā)酵液于4 000 r/min離心5 min，所得上清即為粗酶液。木聚糖酶酶活力的測(cè)定參照GB/T 23874—2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測(cè)定分光光度法》[6]，酶活力單位定義為1 min釋放 1 μmol 還原糖（以木糖計(jì)）所需要的酶量。

1.4.5產(chǎn)木聚糖酶條件優(yōu)化（1）碳源。碳源作為微生物重要的能量與結(jié)構(gòu)來源，對(duì)菌株生長及產(chǎn)酶有著重要的作用[8]。分別以10 g/L麩皮（粉碎過30目篩）、玉米芯（粉碎過30目篩）、木聚糖、淀粉、葡萄糖、蔗糖、木糖7種物質(zhì)作為菌株MJ-23生長的唯一碳源，研究碳源對(duì)菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。（2）氮源。分別以無機(jī)氮源：氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨以及有機(jī)氮源：尿素、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏為唯一氮源進(jìn)行液體發(fā)酵，添加量均為10 g/L 。（3）接種量。設(shè)接種量分別為1、5、10、15、20、25枚/瓶。

1.4.6木聚糖酶酶活穩(wěn)定性的測(cè)定取1%木聚糖溶液于刻度試管中，作為底物，加入2 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液，于設(shè)定的溫度、pH值及其他條件（金屬離子、化學(xué)助劑等）下處理一定時(shí)間后，用DNS法測(cè)酶活力。

1.4.7飼料原料的制備將常用的飼料原料底物如豆粕、玉米粉、菜籽粕、麩皮、玉米芯粉等干燥、粉碎后過30目。按照不同動(dòng)物的飼料配方將上述原料混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆?。育肥豬飼料配方為：21%豆粕，61%玉米粉，1%菜籽粕，8%麩皮，1%棉粕，2%魚粉；另外6%為石粉、蛋氨酸、賴氨酸、微量元素、多種維生素等物質(zhì)。肉雛雞飼料配方為：55%玉米粉，32%豆粕，2%魚粉，2%菜籽粕，3%骨粉；另外6%為蛋氨酸、賴氨酸、微量元素、多種維生素等物質(zhì)。

1.4.8木聚糖酶在飼料原料中的應(yīng)用設(shè)計(jì)對(duì)照組（不加酶）、加酶組2個(gè)處理[7]，取10 g飼料底物加入100 mL緩沖液中，混勻后浸泡30 min，加入5 mL緩沖液或粗酶液，酶解溫度55 ℃，每隔1 h混勻1次，用5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。酶解后對(duì)加酶組和對(duì)照組的樣品分別均勻取樣，4 000 r/min 離心2 min，用DNS法測(cè)定木糖產(chǎn)生量。

2結(jié)果與分析

2.1木聚糖酶分泌菌的分離與鑒定

通過富集培養(yǎng)與木聚糖平板初篩，挑選到透明圈較大的單菌落，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行反復(fù)純化。經(jīng)過酶活檢測(cè)，最終確定以產(chǎn)酶高的菌株MJ-23作為后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)菌。該菌株在PDA培養(yǎng)基上生長良好，菌落正面呈白色，背面呈較深的黃褐色；菌落形態(tài)較大，質(zhì)地相對(duì)緊密，由菌絲組成疏松的絨毛或棉花狀，菌落邊緣不齊整，有明顯的隆起，在培養(yǎng)基中沒有固定的形狀，可延續(xù)至整個(gè)培養(yǎng)基中。菌株所產(chǎn)孢子主要有3種形態(tài)：個(gè)體形態(tài)較大的鐮刀形、有隔膜的分生孢子，個(gè)體形態(tài)較小的、單細(xì)胞卵圓形孢子，以及厚垣孢子。

以MJ-23的DNA為模板，用真菌基因序列通用引物ITS1、ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度約為1 033 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。在GenBank上比對(duì)該序列，根據(jù)Blast分析結(jié)果，結(jié)合菌株菌體形態(tài)與孢子特征，鑒定該菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），GenBank收錄號(hào)：KF751873。

2.2菌株MJ-23產(chǎn)木聚糖酶條件的優(yōu)化

2.2.1木聚糖酶的產(chǎn)酶曲線由圖1木聚糖酶的產(chǎn)酶曲線可以看出，在發(fā)酵過程中，0～36 h內(nèi)菌株的產(chǎn)酶量很低，這主要是由于此時(shí)菌株處于延遲期，并且作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，木聚糖酶在菌株培養(yǎng)一定時(shí)間后才會(huì)產(chǎn)生；菌株產(chǎn)酶的高峰期為70～90 h，以發(fā)酵72 h時(shí)的酶活最高，96 h后酶活力開始明顯下降，因此在后續(xù)研究中，選取72 h作為培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行研究。

2.2.2碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響由圖2可以看出，以木聚糖為碳源時(shí)，木聚糖酶活力最大；麩皮和玉米芯等結(jié)構(gòu)中含有木聚糖成分的底物對(duì)誘導(dǎo)木聚糖酶產(chǎn)生也具有促進(jìn)作用；蔗糖和淀粉對(duì)木聚糖酶的誘導(dǎo)作用較小，這主要是因?yàn)槟揪厶敲甘且环N誘導(dǎo)酶，其合成受誘導(dǎo)調(diào)控，不同誘導(dǎo)物對(duì)菌株MJ-23合成木聚糖酶的誘導(dǎo)能力不同[9]，因此木聚糖及組分中含木聚糖酶成分的底物是最適的誘導(dǎo)底物。

2.2.3氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響由圖3可以看出，對(duì)于菌株MJ-23來說，營養(yǎng)豐富的有機(jī)氮源比無機(jī)氮源效果要好；有機(jī)氮源中的酵母粉、蛋白胨、牛肉膏對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，其中以酵母粉的促進(jìn)作用最為顯著，而尿素對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響較弱；無機(jī)氮源中，硫酸銨的促進(jìn)作用最強(qiáng)，硝酸鈉最低。分析出現(xiàn)上述情況的原因，可能是菌株對(duì)不

同來源氮源的利用偏好性有所不同[10]。

2.2.4接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響由圖4接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)可知，接種5～10枚/瓶菌時(shí)所測(cè)得酶活較高，

接種量為1枚/瓶或大于15枚/瓶時(shí)，木聚糖酶活性均較大幅度降低。分析其原因可能是：接種量過低，菌絲體生物量較低，致使產(chǎn)酶周期延長，72 h時(shí)無法達(dá)到較高的產(chǎn)酶量；接種量過高，生物量增多導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，同樣不利于木聚糖酶的合成，使得產(chǎn)酶量降低[11]。

2.3木聚糖酶的酶學(xué)特性

木聚糖酶的酶活力受到多種因素影響，如溫度、pH值、金屬離子、激活劑或抑制劑等[12]。本研究探討環(huán)境因素對(duì)木聚糖酶酶學(xué)特性的影響，以期確定酶的水解條件與影響因素。

2.3.1木聚糖酶最適反應(yīng)溫度在緩沖液pH值為6.0，溫度分別為30、40、50、55、60、70、80 ℃條件下處理粗酶液 20 min，測(cè)定木聚糖酶活力。由圖5可知，菌株產(chǎn)木聚糖酶的最適作用溫度為55 ℃，可耐受溫度相對(duì)較高，并且在50～60 ℃ 溫度范圍內(nèi)，酶活力相對(duì)比較穩(wěn)定。

2.3.2木聚糖酶最適反應(yīng)pH值pH值是影響木聚糖酶活力的重要因素，過高或過低的pH值均會(huì)改變木聚糖酶蛋白的構(gòu)象，使酶活力降低，甚至?xí)?dǎo)致木聚糖酶變性失活。生物來源不同的木聚糖酶所能耐受的pH值范圍一般不同[13]，真菌來源的木聚糖酶多在酸性條件下具有最大活力，最適pH值范圍一般為4.0～6.0[14]。由圖6木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值試驗(yàn)結(jié)果看出：pH值=6時(shí)，該酶活力最高，并且在pH值

為5～7范圍內(nèi)可以保持較高活性，是一種酸性木聚糖酶，認(rèn)為該酶具有用作飼料工業(yè)用酶的前景；當(dāng)pH值小于4或大于9時(shí)，木聚糖酶活性均下降明顯，開始失活。

2.3.3木聚糖酶活力的熱穩(wěn)定性由圖7恒溫處理對(duì)木聚糖酶活力影響的結(jié)果看出：以起始酶活力為對(duì)照，在55 ℃、pH值=6的條件下處理2 h后，測(cè)得的木聚糖酶相對(duì)活力仍可維持95%以上；反應(yīng)3 h時(shí)下降到起始酶活力的90%左右；4 h以后開始出現(xiàn)較大幅度的下降。與其他木聚糖酶[15]相比，該酶的酶活力熱穩(wěn)定性較好。

2.3.4金屬離子對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響木聚糖酶有細(xì)菌、真菌等多種來源，不同金屬離子對(duì)不同酶活力的影響不同，并且離子之間的相互作用對(duì)木聚糖酶也有影響[12]。本研究探討金屬離子對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響，金屬離子濃度設(shè)為 1 mmol/L，試驗(yàn)中以未添加金屬離子樣品的酶活力為對(duì)照，其相對(duì)酶活默認(rèn)為100%。由圖8研究結(jié)果表明：Ca2+、Fe2+、Mn2+對(duì)木聚糖酶的活力有較強(qiáng)的激活作用，I-、Mg2+對(duì)酶活力的大小基本上沒有影響，K+、Na+對(duì)酶活力有輕微的抑制作用，Cu2+、Zn2+對(duì)木聚糖酶的活力有較大的抑制作用。

2.3.5化學(xué)助劑對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響研究濃度為1 g/L的不同表面活性劑樣品對(duì)木聚糖酶活穩(wěn)定性的影響，設(shè)不加化學(xué)助劑樣品的酶活力為對(duì)照，數(shù)值為100%。圖9結(jié)果表

明：聚乙二醇和Tween 80對(duì)木聚糖酶的活力都有促進(jìn)作用，其中Tween 80的促進(jìn)作用較大；Tris對(duì)酶活力的影響較小，而EDTA、尿素和SDS對(duì)木聚糖酶的活力均有不同程度的抑制作用，其中SDS的抑制作用最為強(qiáng)烈，酶活損失達(dá)50%以上。

2.4木聚糖酶在飼料中的應(yīng)用研究

目前，關(guān)于酶制劑在飼料中實(shí)際功能的量化測(cè)定方法還未完善。有研究對(duì)體外模擬動(dòng)物消化過程進(jìn)行測(cè)定，如采集出欄豬的胃液，加入酶制劑測(cè)定其中單一變量[16]，且大多數(shù)研究還是采用單一因素測(cè)定飼料中的碳氮源，以及配制飼料原料綜合比較的方法進(jìn)行測(cè)定。

一般來說，豬胃液的pH值為2.0～3.5，十二指腸、空腸、回腸的pH值范圍分別為4.0～6.0、5.5～6.7、7.0～7.5。飼料在豬體內(nèi)首先被胃酸分解成食糜狀，這一過程基本沒有被吸收，糜狀物進(jìn)入小腸后才被消化吸收。家禽肉雞的胃液pH值約為2.0～3.0，腸道內(nèi)pH值為6.0～6.5，食物的消化過程與豬基本相同[17]。本試驗(yàn)中，篩選的酸性木聚糖酶最適pH值為5～7，理論上可應(yīng)用于飼料工業(yè)。

本研究中，所有飼料原料均經(jīng)粉碎后過30目篩，且在緩沖液中浸泡30 min，以模擬動(dòng)物體內(nèi)消化道的酸化及糜化作用。其中豬飼料選用pH值5.5的醋酸緩沖，雞飼料選用pH值6.0的醋酸緩沖。由于飼料在雞體內(nèi)的消化時(shí)間為 2～4 h，在豬體內(nèi)的消化時(shí)間比雞長，因此雞飼料酶解時(shí)間選用4 h，豬飼料酶解時(shí)間選用6 h[18]。通過測(cè)定添加木聚糖酶前后飼料中木糖含量的變化，定量分析木聚糖酶在飼料中的作用[19]。研究結(jié)果（圖10）表明：木聚糖酶對(duì)豬飼料的降解作用顯著，可使飼料中木糖含量提高28%；對(duì)雞飼料也有明顯作用，木糖含量提高了16%。分析2種飼料中木聚糖酶作用差異的原因，可能是飼料配方中玉米含量的不同所造成的：玉米、小麥、豆粕中均含有大量的非淀粉多糖，但玉米中木聚糖含量相對(duì)較高，因而飼料成分中含玉米較多的豬飼料經(jīng)木

聚糖酶處理后得到的木糖含量更高[20]。

3討論

木聚糖酶的制備與應(yīng)用對(duì)于植物性原料來源的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。本研究從土壤中分離得到1株產(chǎn)木聚糖酶較高的菌株MJ-23，經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），隨后對(duì)其產(chǎn)酶條件與酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。研究表明，木聚糖是最佳的木聚糖酶誘導(dǎo)底物，以酵母粉作為氮源有利于木聚糖酶的產(chǎn)生；在最適培養(yǎng)條件下，液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活性可達(dá)186 U/mL；該酶的最適作用溫度與pH值分別為55 ℃、6，并且55 ℃恒溫3 h后酶活仍可達(dá)到初始酶活的90%以上，是一種溫度穩(wěn)定性較好的酸性木聚糖酶。Ca2+、Fe2+、Mn2+、聚乙二醇和Tween 80對(duì)木聚糖酶的活性有較強(qiáng)的激活作用，Cu2+、Zn2+、EDTA、尿素和SDS對(duì)木聚糖酶有抑制作用，其中SDS的抑制作用最強(qiáng)。

將制備的木聚糖酶應(yīng)用于飼料研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶的添加可使豬飼料中木糖含量提高28%，雞飼料中木糖含量提高16%?？梢娔揪厶敲傅奶砑佑欣谪i、雞飼料中植物纖維原料的降解，提高飼料利用率。

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