焦永吉，王悶靈，趙云波，趙世民，張涵，蔣士君

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,鄭州市文化路95號(hào)450002；

2 河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司,洛陽(yáng)市開(kāi)元大道246號(hào)471000；

3 河南省洛陽(yáng)市煙草公司宜陽(yáng)分公司,洛陽(yáng)市宜陽(yáng)縣紅旗中路32號(hào)471600；

4 河南省洛陽(yáng)市煙草公司汝陽(yáng)分公司,洛陽(yáng)市汝陽(yáng)縣人民路41號(hào)471200

植物保護(hù)

河南省煙草根結(jié)線蟲(chóng)種類的PCR鑒定與種群分析

焦永吉1，王悶靈2，趙云波3，趙世民2，張涵4，蔣士君1

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,鄭州市文化路95號(hào)450002；

2 河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司,洛陽(yáng)市開(kāi)元大道246號(hào)471000；

3 河南省洛陽(yáng)市煙草公司宜陽(yáng)分公司,洛陽(yáng)市宜陽(yáng)縣紅旗中路32號(hào)471600；

4 河南省洛陽(yáng)市煙草公司汝陽(yáng)分公司,洛陽(yáng)市汝陽(yáng)縣人民路41號(hào)471200

為明確河南省煙田根結(jié)線蟲(chóng)種群分布及比例,采集了12份煙草根結(jié)線蟲(chóng)樣本。通過(guò)對(duì)線蟲(chóng)樣本的PCR分子檢測(cè)和雌成蟲(chóng)會(huì)陰花紋的形態(tài)鑒定,結(jié)果表明,檢出煙草根結(jié)線蟲(chóng)4種,其中南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）檢出率為55.83%,花生根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne arenaria）23.33% ,北方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne hapla）17.50% ；爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne javanica）3.33%。種群分析表明河南地區(qū)仍以南方根結(jié)線蟲(chóng)為主,同時(shí)其他種類根結(jié)線蟲(chóng)的發(fā)生危害比例在上升。所有樣本均為混合侵染,南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)在河南廣泛分布,具有普遍性；爪哇根結(jié)線蟲(chóng)在河南分布沒(méi)有規(guī)律性。

根結(jié)線蟲(chóng)；PCR分子檢測(cè)；會(huì)陰花紋鑒定

世界范圍內(nèi)為害煙草的線蟲(chóng)主要有根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogynespp.）、 胞 囊 線 蟲(chóng)（Heterodrasp.）和根腐線蟲(chóng)（Paratylenchusspp.）三大類[1],引起溫帶和亞熱帶煙草較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中根結(jié)線蟲(chóng)（root-knot nematode）是煙草上最重要、最常見(jiàn)的有害線蟲(chóng)之一[2],是世界各國(guó)煙草生產(chǎn)中重要病害之一,也是當(dāng)前在我國(guó)煙草發(fā)生范圍最廣、為害最重、防治難度大的線蟲(chóng)。根結(jié)線蟲(chóng)相比其他植物病原——真菌、細(xì)菌、病毒等,具有主動(dòng)侵襲寄生和自行轉(zhuǎn)移為害的特點(diǎn),此外,還能與有些病原真菌、細(xì)菌、病毒互作,共同致病造成復(fù)合病害,或以刺激、誘導(dǎo)、傳帶等協(xié)同方式促進(jìn)這三種病害的加重,可以說(shuō),線蟲(chóng)具有雙重性病原的特點(diǎn)[3]。據(jù)據(jù)2002年的我國(guó)煙草業(yè)統(tǒng)計(jì),全國(guó)根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生面積為10.83萬(wàn)公頃,直接為害所造成的煙葉經(jīng)濟(jì)損失7917.84萬(wàn)元,占侵染性病害所致?lián)p失的5.7%[4]。

當(dāng)前河南省大多數(shù)煙田為旱坡地輕砂質(zhì)土或砂壤土,且多年連續(xù)種煙,難以實(shí)行水旱輪作、冬灌以及與其他作物的輪作倒茬,加之高抗線蟲(chóng)病煙草品種的缺乏、全球性氣候變暖以及我國(guó)冬季的多樣性種植,作物線蟲(chóng)病的發(fā)生已呈持續(xù)加重之勢(shì),并造成了許多復(fù)合病害或繼發(fā)感染,已成為制約煙草生產(chǎn)的嚴(yán)重障礙。

本研究采用PCR分子檢測(cè)法,結(jié)合根結(jié)線蟲(chóng)會(huì)陰花紋形態(tài)觀察法對(duì)采自河南省主產(chǎn)煙區(qū)8個(gè)縣12份煙草根結(jié)線蟲(chóng)樣品進(jìn)行了鑒定,旨在明確當(dāng)前河南煙區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)的種群分布,為科學(xué)制定河南煙草根結(jié)線蟲(chóng)的防治規(guī)劃和抗線蟲(chóng)病育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2012年,根據(jù)煙葉生產(chǎn)中根結(jié)線蟲(chóng)的發(fā)生情況,在河南省煙區(qū)選擇了具有代表性的8個(gè)煙葉生產(chǎn)重點(diǎn)縣進(jìn)行了根結(jié)線蟲(chóng)病調(diào)查。每地塊或0.0667～0.333 hm2小區(qū)內(nèi)取1個(gè)混合樣,包括5個(gè)小樣。這5個(gè)小樣分別采自五點(diǎn)法選定的5株煙草。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 本研究中的煙草根結(jié)線蟲(chóng)樣本來(lái)源信息Tab.1 Source information of sample tobacco root-knot nematode

1.2 根結(jié)線蟲(chóng)基因組DNA的提取

采用CTAB法略做改進(jìn)。將清洗過(guò)的根結(jié)剪碎混勻,取1 g置于玻璃勻漿器中,加入2 mL的預(yù)熱65℃的2 % CTAB抽提緩沖液,充分研磨勻漿,將勻漿液分倒入1.5 mL的滅菌離心管中,勻漿液的高度約占管的三分之二,將離心管置于65 ℃的金屬浴中,每隔10 min輕輕搖動(dòng),40 min后取出,冷卻后,加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管,上下顛倒振蕩2～3 min,使兩者混合均勻,10,000 rpm×10 min,與此同時(shí),將600 μL的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中,移液器輕輕地吸取上清夜,轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi),將離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)30 s,使異丙醇與水層充分混合至能見(jiàn)到DNA絮狀物,10,000 rpm×1 min后,立即倒掉上清液,再加入800 uL75%的乙醇,將DNA洗滌30 min,10,000 rpm×30 s后,立即倒掉液體,將離心管放在75 ℃的水浴中使酒精揮發(fā),當(dāng)沒(méi)有酒精氣味時(shí)取出加入80 μL TE溶解,–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

研究采用的25 uL PCR反應(yīng)體系如下：線蟲(chóng)模板DNA 1 μL,上下游引物（20 μM）各1 μL,2×TaqMasterMix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。試驗(yàn)所用引物有4組,基本信息見(jiàn)表2。

PCR 擴(kuò)增條件為 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s,61 ℃30 s,72 ℃ 60 s (DjF/DjR為90 s) ,40個(gè)循環(huán),72 ℃10 min,設(shè)置無(wú)任何DNA的模板為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增后,取8 uL 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,用1×TAE緩沖液在100 V下電泳40 min,EB染色15 min,紫外燈下觀察并照相。

表2 本研究中的PCR引物序列信息Tab.2 Sequence infomation of primers

1.4 會(huì)陰花紋的制作及觀察

用挑針在體視顯微鏡下解剖根結(jié),隨機(jī)挑取不同側(cè)根上的成熟雌成蟲(chóng),每個(gè)種群挑取20條移入硬塑料板上清水滴中,用單面刀片或解剖刀切下線蟲(chóng)尾部,用解剖針慢慢移走其它蟲(chóng)體和碎片,修剪尾部表皮成方塊狀,使會(huì)陰花紋處于方塊中央,清水中清洗3次,把會(huì)陰部移到滴有一滴清水的載玻片上,加蓋玻片。在顯微鏡下觀察會(huì)陰花紋的形態(tài)特征并拍照,參照文獻(xiàn)[9-11]進(jìn)行分類鑒定,統(tǒng)計(jì)各個(gè)種所占比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于PCR的鑒定結(jié)果

M MC1 MC2 LN YY1 YY2 RY1 RY2 RY3 XC XX JX QS N

圖1 南方根結(jié)線蟲(chóng)引物對(duì)（A）、花生根結(jié)線蟲(chóng)引物對(duì)（B）、北方根結(jié)線蟲(chóng)引物對(duì)（C）、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)引物對(duì)（D）擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplifications with primer sets MiSF／MiSD(A),Far／Rar(B),Mh-F/Mh-R(C) and DjF/DjR(D)

根據(jù)南方根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物MiSF／MiSD對(duì)供試線蟲(chóng)種群的PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1A)表明,所有12份檢樣均擴(kuò)增出了502 bp長(zhǎng)的目標(biāo)DNA片段,說(shuō)明所有檢樣中均有南方根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita）存在。

花生根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物Far／Rar對(duì)供試線蟲(chóng)種群的PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1B)表明,來(lái)自澠池、洛寧、宜陽(yáng)、許昌、襄城縣、郟縣、確山等7縣的9份檢樣中均擴(kuò)增出420 bp長(zhǎng)的目標(biāo)DNA片段,表明了檢樣中存在花生根結(jié)線蟲(chóng)（M.arenaria）。

北方根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物Mh-F/Mh-R對(duì)供試線蟲(chóng)種群的PCR擴(kuò)增（圖1C)表明,所有檢樣均擴(kuò)增出462 bp長(zhǎng)的目標(biāo)DNA片段,說(shuō)明所有12份檢樣中均有北方根結(jié)線蟲(chóng)（M.hapla）存在。

利用爪哇根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物DjF/DjR進(jìn)行的PCR擴(kuò)增（圖1D)表明,僅有來(lái)自澠池、洛寧、宜陽(yáng)、許昌、郟縣等5縣的6份檢樣擴(kuò)增出了爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M.javanica）的1650 bp目標(biāo)片段。

2.2 基于會(huì)陰花紋的形態(tài)鑒定結(jié)果

基于雌成蟲(chóng)會(huì)陰花紋特征的鑒定結(jié)果列于表3?？梢郧逦吹?來(lái)自豫西煙區(qū)的澠池、洛寧、宜陽(yáng)和來(lái)自豫中煙區(qū)的許昌、郟縣的檢樣中四種根結(jié)線蟲(chóng)都存在；來(lái)自豫南確山的檢樣中存在三種根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita、M.arenaria、M.hapla）；但同樣來(lái)自豫西煙區(qū)的汝陽(yáng)3份檢樣中僅存在兩種根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita、M.hapla）。所檢樣本均為混合侵染。

比較PCR鑒定結(jié)果與會(huì)陰花紋形態(tài)鑒定結(jié)果（表3）,可以看出兩種方法的鑒定結(jié)果一致,說(shuō)明基于PCR的根結(jié)線蟲(chóng)種類鑒定比較可靠,且省工省時(shí)。但我們認(rèn)為PCR法比較適于種類的定性檢測(cè)與鑒定,會(huì)陰花紋法比較適于種群構(gòu)成的定量分析。

圖2 光學(xué)顯微鏡下南方根結(jié)線蟲(chóng)（A）、花生根結(jié)線蟲(chóng)(B)、北方根結(jié)線蟲(chóng)(C)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(D)的會(huì)陰花紋形態(tài)Fig.2 Photographs of perineal patterns of M.incognita (A), M.arenaria (B）, M.hapla (C）,M.javanica (D）LM

研究結(jié)果還表明,南方根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)普遍存在于河南省煙田土壤中,花生根結(jié)線蟲(chóng)存在于汝陽(yáng)煙區(qū)之外的所有煙田,而爪哇根結(jié)線蟲(chóng)僅局部分布,但看不出其分布的規(guī)律性。種群構(gòu)成上,南方根結(jié)線蟲(chóng)是河南省煙草根結(jié)線蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種群,平均檢出率達(dá)55.83 %,其次為花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng),分別占23.33 %和17.50 %,而爪哇根結(jié)線蟲(chóng)比例最小,僅占3.33 %。盡管來(lái)自不同地區(qū)的根結(jié)線蟲(chóng)種群數(shù)量存在著差異,如汝陽(yáng)煙田僅檢出南方根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)等兩種根結(jié)線蟲(chóng),但看不出種群分布與地理來(lái)源之間的相關(guān)性,且同一地區(qū)的各種根結(jié)線蟲(chóng)所占比例也存在著差異。

表3 根結(jié)線蟲(chóng)樣本的PCR鑒定和會(huì)陰花紋鑒定結(jié)果比較Tab.3 Identification of tobacco RKN samples by PCR-based method and perineal pattern-based method

3 結(jié)論與討論

了解根結(jié)線蟲(chóng)病病原種類是培育和選用抗病品種的基礎(chǔ)。手段多元化是根結(jié)線蟲(chóng)分類上的一個(gè)顯著特點(diǎn)[12]。用于根結(jié)線蟲(chóng)的分類手段常見(jiàn)的有傳統(tǒng)方法（包括形態(tài)學(xué)鑒定方法、鑒別寄主輔助鑒別實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遺傳學(xué)方法和同工酶電泳技術(shù)）和現(xiàn)代分子生物技術(shù)（RFLP、 AFLP、RAPD、SCAR等）。本研究采用PCR技術(shù)與形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法,對(duì)河南煙區(qū)的根結(jié)線蟲(chóng)種類進(jìn)行了定性分析和流行學(xué)調(diào)查。

朱賢朝等[1]曾對(duì)河南省煙草根結(jié)線蟲(chóng)病進(jìn)行了報(bào)道,認(rèn)為河南省煙草上存在南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)4種根結(jié)線蟲(chóng),其中南方根結(jié)線蟲(chóng)占83.3 %。李淑君等[13]曾對(duì)河南省煙草根結(jié)線蟲(chóng)病進(jìn)行了初步研究,認(rèn)為河南省煙草上存在南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、高弓根結(jié)線蟲(chóng)5種根結(jié)線蟲(chóng)；南方根結(jié)線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)是河南的優(yōu)勢(shì)種。海飛[14]曾對(duì)河南省的經(jīng)濟(jì)作物根結(jié)線蟲(chóng)種類作了初步鑒定,認(rèn)為南方根結(jié)線蟲(chóng)是河南地區(qū)最大的優(yōu)勢(shì)種群,在鑒定標(biāo)本中出現(xiàn)頻率為47.22%,花生根結(jié)線蟲(chóng)是次優(yōu)勢(shì)種群,在鑒定標(biāo)本中出現(xiàn)頻率為36.11%,南方根結(jié)線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染的比例為l1.1l%,北方根結(jié)線蟲(chóng)的出現(xiàn)頻率為5.5%,未發(fā)現(xiàn)爪哇根結(jié)線蟲(chóng)。

本研究采樣的8個(gè)縣分布在豫西、豫中、豫南,所得結(jié)果有較好的代表性。由鑒定結(jié)果看,在河南省南方根結(jié)線蟲(chóng)約占55.83 %,花生根結(jié)線蟲(chóng)約占23.33 %,北方根結(jié)線蟲(chóng)約占17.50 %,爪哇根結(jié)線蟲(chóng)約占3.33 %。河南省仍以南方根結(jié)線蟲(chóng)占優(yōu)勢(shì),花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)的危害也較為嚴(yán)重,形態(tài)鑒定和分子鑒定均鑒定到爪哇根結(jié)線蟲(chóng)的存在,所有樣本均為混合侵染,南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)在河南省的分布具有普遍性,而爪哇根結(jié)線蟲(chóng)在河南省分布沒(méi)有規(guī)律性。調(diào)查結(jié)果與朱賢朝報(bào)道的結(jié)果相比,南方根結(jié)線蟲(chóng)的比例有很大的下降,這可能與單抗南方根結(jié)線蟲(chóng)煙草品種的長(zhǎng)期種植有關(guān)。調(diào)查結(jié)果與海飛[14]的調(diào)查結(jié)果相比,南方根結(jié)線蟲(chóng)有所上升,花生根結(jié)線蟲(chóng)有所下降,這可能與海飛的樣品中煙草根樣所占比例（≤10 %）有關(guān)；同時(shí)也與煙草的輪作制度有關(guān)——不同的輪作作物對(duì)線蟲(chóng)的抗感性不同,如在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)汝陽(yáng)大面積種植花生,由鑒別寄主試驗(yàn)可知只有花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)侵染花生,而當(dāng)?shù)刂淮嬖谀戏礁Y(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng),當(dāng)?shù)責(zé)煵菖c花生輪作必然會(huì)引起北方根結(jié)線蟲(chóng)比例上升,導(dǎo)致汝陽(yáng)地區(qū)北方根結(jié)線蟲(chóng)所占比例明顯高于其他地方。調(diào)查結(jié)果與海飛[14]的調(diào)查結(jié)果相比所有樣品均為混合侵染,這可能與樣品的采集地點(diǎn)有關(guān)。本研究采用大田取樣,環(huán)境相對(duì)開(kāi)放,利于線蟲(chóng)種群交流,因此線蟲(chóng)病害多為混發(fā)；而海飛[12]調(diào)查的瓜果蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物多為設(shè)施地栽培,環(huán)境相對(duì)孤立、封閉,不利于線蟲(chóng)種群交流,因此多為單一物種危害。

本研究反映了河南一些煙草生產(chǎn)地區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)的種群分布情況,有利于進(jìn)一步了解根結(jié)線蟲(chóng)的動(dòng)態(tài)變化,對(duì)于線蟲(chóng)病的防治工作和煙草抗線蟲(chóng)病育種工作的開(kāi)展起到了一定的促進(jìn)作用。由于我國(guó)煙區(qū)分布廣泛、生態(tài)條件復(fù)雜,為害煙草的線蟲(chóng)情況不盡相同,仍需做大量基礎(chǔ)的調(diào)查研究工作。由于時(shí)間的局限性本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行鑒別寄主試驗(yàn)以明確到生理小種,同時(shí)擴(kuò)增片段DNA的測(cè)序及種群親緣關(guān)系分析等后續(xù)工作也有待進(jìn)行。

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PCR-based identification of root-knot nematodes (Meloidogynespp)in tobacco in Henan province

JIAO Yongji1, WANG Menling2,ZHAO Yunbo3,ZHAO Shimin2,ZHANG Han4, JIANG Shijun1
1 College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
2 Henan Luoyang Tobacco Company, Luoyang 471000, China;
3 Yiyang Branch, Henan Luoyang Tobacco Company, Yiyang 471600, China;
4 Ruyang Branch, Henan Luoyang Tobacco Company, Ruyang 471200, China

Root-knot nematode is one of the most important diseases in tobacco in Henan province.12 samples were collected from 8 counties from main tobacco planting areas.Perineal pattern-based morphological and PCR-based molecular identification revealed that 4 species ofMeloidogynewere detected.of whichM.incognitaaccounted for 55.83%,M.arenaria23.33%,M.hapla17.50% andM.javanica3.33%.Meloidogyne incognitawas dominant although other species in the pathogen population of tobacco root-knot nematode were increasing.All samples showed mixed infection.M.incognita, M.arenariaandM.haplawere very common and widely distributed in Henan whileM.javanicadistributed unevenly.

root-knot nematode (Meloidogynespp.）；PCR molecular detection； perineal pattern identification

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.013

S435.72; Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1004-5708（2014）03-0079-05

中國(guó)煙草總公司項(xiàng)目“全國(guó)煙草有害生物調(diào)查研究”（110200902065）

焦永吉（1988—）,碩士研究生,從事線蟲(chóng)病害研究,Email：jiaoyongji@126.com

蔣士君（1964—）,副教授,主要從事煙草病理學(xué)研究,Email：jiangsj001@163.com

2013-05-14