傅學(xué)才

（湖南省婁底市婁星區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，湖南婁底417000）

豬鏈球菌的分離、16SrRNA鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)

傅學(xué)才

（湖南省婁底市婁星區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，湖南婁底417000）

從湖南婁底某豬場病豬組織中分離出6株細(xì)菌，通過培養(yǎng)特性、細(xì)菌染色鏡檢、16sRNA基因擴(kuò)增及序列BLAST分析等系統(tǒng)鑒定，確定為豬鏈球菌。并對分離菌與GenBank中收錄的17株豬鏈球菌的16SrRNA基因序列的進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示,6株分離菌的16SrRNA基因序列與收錄菌株同源性為99%以上。藥物敏感試驗(yàn)表明，分離細(xì)菌對頭孢類、β內(nèi)酰胺類藥物高度敏感、對磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類藥物產(chǎn)生耐藥。而6株分離細(xì)菌對氯霉素類藥物的敏感，但敏感性有差異。

豬鏈球菌，16SrRNA基因，藥物敏感實(shí)驗(yàn)

豬鏈球菌病是一種人畜共患的急性、熱性傳染病，可致豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、多發(fā)性漿膜炎。臨床表現(xiàn)為急性出血性敗血癥、哺乳仔豬下痢和孕豬流產(chǎn)等，可致生豬死亡，危害較嚴(yán)重。據(jù)報道血清型眾多，目前有35個血清型，而且變異頻繁。筆者在湖南婁底某豬場剖檢了疑是豬鏈球菌病的生豬2頭，從采集的組織樣中分離出6株細(xì)菌，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)、16SrRNA等系統(tǒng)鑒定，確定為豬鏈球菌?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

湖南省婁底的兩個豬場采集的三元仔豬2頭和6份病料。鮮血瓊脂、巧克力瓊脂購自江門市凱林貿(mào)易有限公司。即用型PCR Mix試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，藥敏紙片分別購自上杭州微生物試劑公司

1.2 細(xì)菌分離

將采集的組織病料在超凈工作臺內(nèi)接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)特征，挑取疑是豬鏈球菌的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.3 細(xì)菌染色鏡檢

挑取疑是豬鏈球菌純培養(yǎng)菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色、顯微鏡下鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.4 細(xì)菌PCR檢測和測序

1.4.1 細(xì)菌基因組DNA的提取

用煮沸方法提取細(xì)菌DNA模板，離心過夜培養(yǎng)菌液，加入150μLTE緩沖液混均后，沸水中煮沸10min，冰浴后離心取上清夜做PCR反應(yīng)的模板。

1.4.2 對分離菌進(jìn)行PCR鑒定

按Makino S的方法設(shè)計豬鏈球菌16SrRNA（M23728）PCR引物。上游引物P1：

5’-ACGCGTAGGTAACCTGCCTC-3’，下游引物 P2：5’-GCCATTGTAGCACGTGTGT-3’。 擴(kuò)增片段理論長度為1130bp。反應(yīng)體系（50μL）：10×Taq bufer 5.0μL，dNTPs（2 mmol／L）5.0μL，MgCl2（20mmol／L）3.0μL，上下游引物（20 p mol／μL）各 2.0μL，Taq DNA聚合酶（2 U/μL）1.5μL，模板2.5μL，滅菌雙蒸水29.0μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 2 min；94℃ 1min，56℃ 2min，72℃ 2 min，30 個循環(huán)；72℃延伸7 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.4.3 測序

PCR產(chǎn)物送上海生工測序，測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對。

1.5 藥敏試驗(yàn)

選擇鑒定豬鏈球菌的菌株培養(yǎng)液涂布接種于鮮血瓊脂平板，在無菌操作條件先將將藥敏試紙片平貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測量其抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌特性

2.1.1 從采集的病豬組織樣品中分離到13株細(xì)菌，其中6株出現(xiàn)α溶血現(xiàn)象。

2.1.2 6株出現(xiàn)α溶血現(xiàn)象細(xì)菌染色鏡檢為呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌（見圖1）。

2.2 PCR鑒定

分離菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1130 bp大小的片段，與預(yù)期目的片段相符（見圖2）。

2.3 同源性比對

對分離菌采用16S rRNA的引物對其可變區(qū)基因進(jìn)行克隆、測序和同源性比對,并用BLAST軟件分析其同源性。結(jié)果表明,此6株菌株通過同源性比對,與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的17株鏈球菌的16SrRNA基因序列同源性均大于99%,16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3）。

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2.4 藥敏試驗(yàn)

分離菌株對頭孢頭孢噻肟、先鋒霉素、青霉素高度敏感，對復(fù)方新諾明、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、阿奇霉素耐藥，對氨芐西林、恩諾沙星、氟苯尼考的敏感性6株菌有差異。結(jié)果見表1。

2.5 疾病控制

采取欄舍徹底消毒，發(fā)病豬隔離。青霉素或頭孢喹肟配合治療，治療期間飼料中添加一定量的復(fù)合多維和黃芪多糖，有效地控制了疫情，沒有發(fā)生人的感染病例。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在分離菌落的基礎(chǔ)上，采用細(xì)菌16SrRNA基因可初步鑒定豬鏈球菌，而且可以撥開鏈球菌多樣性的干擾，準(zhǔn)確度高。但分型和致病性還要進(jìn)行血清學(xué)分型試驗(yàn)和毒力測定，進(jìn)一步用小白鼠實(shí)驗(yàn)和動物回歸實(shí)驗(yàn)佐證。

對6株分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明該分離菌對頭孢類和β內(nèi)酰胺類高度敏感，與相關(guān)文獻(xiàn)報道豬鏈球菌藥敏結(jié)果不一致，這可能與不同豬場藥物的耐藥性有關(guān)，因此，對于細(xì)菌病的治療最好在藥敏試驗(yàn)基礎(chǔ)上合理用藥。預(yù)防和保健時盡量少用和避免長期使用同一種藥物?！?/p>

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S858.28

A

1006-4907（2014）03-0021-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2014.03.010

2014-05-10