鋸齒狀病變組織中Runx3基因的甲基化及蛋白表達

張玉萍，王魯平，方 園，許春偉，葛 暢

(北京軍區(qū)總醫(yī)院 病理科，北京 100700)

鋸齒狀病變組織中Runx3基因的甲基化及蛋白表達

張玉萍，王魯平*，方 園，許春偉，葛 暢

(北京軍區(qū)總醫(yī)院 病理科，北京 100700)

目的探討Runx3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)和蛋白表達在鋸齒狀病變發(fā)生與癌變通路中的作用及意義。方法用TaqMan 探針為基礎(chǔ)的實時定量PCR(Methylight)法檢測77例鋸齒狀病變(29例HP、29例SSA/P和19例TSA)、16例正常結(jié)直腸組織和14例結(jié)直腸癌中Runx3基因CpG島甲基化狀態(tài)，同時用免疫組化法檢測相應(yīng)組織中Runx3蛋白的表達；并分析兩者之間的關(guān)系。結(jié)果Runx3啟動子CpG島甲基化率在正常和HP、SSA/P、TSA、CRC分別為12.5%(2/16)和17.2%(5/29)、51.7%(15/29)、63.2%(12/19)和78.6%(11/14)。Runx3蛋白陽性表達率在正常和HP、SSA/P、TSA、CRC分別為81.3%(13/16)和72.2%(21/29)、48.3%(14/29)、31.6%(6/19)、21.4%(3/14)。SSA/P、TSA和CRC 3組中Runx3甲基化與Runx3蛋白表達結(jié)果具有相關(guān)性(Plt;0.05)，且為負相關(guān)。結(jié)論Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化是誘導Runx3蛋白表達下調(diào)或缺失的主要原因，在鋸齒狀病變尤其是鋸齒狀腺瘤的發(fā)生及癌變通路中起重要作用。

DNA甲基化；Runx3基因；鋸齒狀病變；免疫組化

鋸齒狀病變(Serrated Lesions)是一組以上皮呈鋸齒狀結(jié)構(gòu)為特征的結(jié)直腸息肉/腺瘤，包括增生性息肉(hyperplastic polyp，HP)、傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma，TSA)、廣基鋸齒狀腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp，SSA/P)；具有惡變?yōu)榻Y(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的潛能，近年來受到臨床病理及分子遺傳學工作者的廣泛關(guān)注。據(jù)最新報告，60%的CRC來自普通腺瘤，35%來自鋸齒狀通路[1]，尤其是來自CpG島甲基化表型(CIMP)的鋸齒狀病變。鋸齒狀通路是與經(jīng)典“腺瘤-癌”并存的一種新的致癌途徑，該通路涉及一系列的表觀遺傳學和基因?qū)W改變[2]。DNA甲基化是表觀遺傳學的一種主要調(diào)控機制，異常甲基化將引起抑癌基因表達下調(diào)甚至沉默，進而導致腫瘤的發(fā)生。

Runx3(runt-related transcription factor 3)基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，基因定位于人染色體1p36.1上，Runx3蛋白在TGF-β(transforming growth factor beta)信號通路中發(fā)揮重要作用。Runx3基因的表達下調(diào)或沉默在多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，啟動子區(qū)CpG島高甲基化是Runx3基因失活的主要機制[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Runx3基因指導TGF-β信號傳導過程而抑制細胞增生并促進凋亡，在結(jié)直腸癌的發(fā)病機制中扮演重要角色[4-5]，而Runx3基因在鋸齒狀通路中作用尚不明確。目前國內(nèi)、外有關(guān)Runx3在鋸齒狀病變中作用的研究報告很少，更沒有相關(guān)表觀遺傳學方面的研究。本研究通過Taqman探針實時熒光定量PCR法來分析鋸齒狀病變中Runx3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，并觀察相應(yīng)組織中Runx3蛋白的表達情況，從而對Runx3基因在鋸齒狀通路中的作用進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本： 收集2007至2012年間北京軍區(qū)總醫(yī)院病理診斷為鋸齒狀病變291例，進行回顧性閱片。 按WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤分類[6]及第2版《診斷病理學》標準，由3名病理醫(yī)師4～5輪閱片，從中篩選出77例鋸齒狀病變(29例HP、29例SSA/P和19例TSA)作為實驗組，并收集16例正常結(jié)直腸組織和14例結(jié)直腸癌作為對照組，所有實驗標本均經(jīng)患者知情同意。

1.1.2 主要試劑和儀器： DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)，甲基化修飾試劑盒(ZYMO公司)，核酸蛋白質(zhì)濃度測量儀B-500(上海創(chuàng)萌生物科技有限公司)，甲基化陽性/陰性對照(ZYMO公司)，實時熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa公司)，Runx3抗體[日本MBL公司(1∶500稀釋)]，PCR引物和探針參照文獻[7]設(shè)計，內(nèi)參基因β-肌動蛋白(β-actin)引物和探針參照文獻[8]設(shè)計(表1)，由上海輝睿生物科技有限公司合成。Mx3000P定量PCR擴增儀(Stratagene公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提?。翰捎肣IAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取組織DNA，將含有DNA組織的蠟塊連切5張10 μm的厚蠟?zāi)?，嚴格按照試劑盒說明步驟進行操作。并用紫外分光光度計測量其純度和濃度備用。

表1 Runx3基因和內(nèi)參基因的引物及探針序列Table 1 The sequence of the primers and the probes of the Runx3 gene and the Reference gene

1.2.2 甲基化修飾：采用EZ DNA Methylation-GoldTMKit(D5005)試劑盒，嚴格按照試劑盒說明步驟進行操作。經(jīng)此步后，DNA序列中未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)。

1.2.3 Taqman探針為基礎(chǔ)的實時定量PCR分析：PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修飾后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL(10 pmol)；探針FAM 0.4 μL(10 pmol)；ROX 0.3 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s，共45個循環(huán)(收集熒光信號)；72 ℃延伸5 min。經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的人的CpG全甲基基因組DNA作為陽性對照，人的CpG去甲基基因組DNA作為陰性對照。所有PCR均做復孔，取其平均值作為結(jié)果。

1.2.4 免疫組織化學染色：所有標本常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，60 ℃溫箱烘烤90 min。采用EnVision二步法，實驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行，高溫高壓抗原修復，DAB顯色，PBS代替一抗為陰性對照，已知陽性的結(jié)腸腺體組織為陽性對照。

1.2.5 結(jié)果判斷標準：TaqMan探針法RT-PCR結(jié)果判斷標準[9]：同時擴增目的基因(Runx3)和內(nèi)參基因(β-actin)，根據(jù)標準曲線得到兩者的原始拷貝數(shù)，計算標準甲基化指數(shù)(the normalized index of methylation, NIM)其定義為：NIM=[(Runx3 sample/Runx3 positive)/ β-actin sample/β-actin positive)]×100，其中Runx3 sample指樣本中甲基化Runx3基因的拷貝數(shù)，Runx3 positive指陽性對照中甲基化Runx3基因的拷貝數(shù)，β-actin sample和β-actin positve與上述相同。NIM≥4為甲基化，NIMlt;4為非甲基化。

免疫組化判斷標準：Runx3陽性定位于細胞核；標記指數(shù)計算方法[10]：每張切片低倍鏡下選擇組織結(jié)構(gòu)良好、比較清晰的5個陽性細胞最為密集的區(qū)域，每個區(qū)域在高倍鏡下，計數(shù)100個細胞中的陽性細胞指數(shù)(不包括間質(zhì)細胞和其他非腫瘤細胞)，計算陽性細胞數(shù)平均值的百分率。標記指數(shù)計分：lt;10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。染色強度計分：淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張切片兩種評分之乘積為該切片最后的表達強度：0分為(-)，1～3分為(+)，4～6分為(++)，≥8分為(+++)。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果運用χ2、Fisher確切概率法及Pearson相關(guān)進行統(tǒng)計學處理，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Runx3基因標準曲線分析

將陽性對照按10的倍數(shù)稀釋成1～1×10-67個濃度梯度制作標準曲線(其拷貝數(shù)為103～109/mL)，各濃度梯度反應(yīng)均做復孔。Taqman探針方法的線性范圍為104～108拷貝/mL，R2為0.998。

2.2 Runx3基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)

通過對樣品的循環(huán)閾值數(shù)(Ct值)和擴增曲線分析：Runx3啟動子CpG島甲基化率在正常組織、HP、SSA/P、TSA和CRC分別為12.5%(2/16)、17.2%(5/29)、51.7%(15/29)、63.2%(12/19)和78.6%(11/14)，正常組織中未測到Runx3啟動子CpG島甲基化。SSA/P、TSA、CRC和正常組及HP組之間有顯著性差異(Plt;0.05)；HP與正常組之間，SSA/P、TSA、CRC 3組之間差異均不顯著(表2;圖1,2)。

表2 基因CpG島甲基化統(tǒng)計結(jié)果Table 2 The survey results of genes CpG Island methylation

*SSA/P, TSA and CRC group compared with normal group respectively;Plt;0.05;#SSA/P, TSA and CRC group compared with HP group respectively;Plt;0.05

圖1 SSA/P、TSA和CRC的MethyLight擴增曲線Fig 1 Expansion curve of MethyLight in SSA/P, TSA and CRC

圖2 HP和正常黏膜組織的MethyLight擴增曲線Fig 2 Expansion curve of MethyLight in HP and normal mucosa tissues

2.3 Runx3蛋白表達

Runx3蛋白陽性表達率在正常、HP、SSA/P、TSA 和CRC分別為81.3%(13/16)、65.5%(19/29)、48.3%(14/29)、31.6%(6/19)和14.3%(2/14)。SSA/P、TSA、CRC和正常組之間有顯著性差異(Plt;0.05)；TSA、CRC和HP組之間有顯著性差異(Plt;0.05)；SSA/P 與CRC之間有顯著性差異(Plt;0.05)；HP與正常組、SSA/P，SSA/P 和TSA之間差異不顯著(表3;圖3，4，5，6)。

表3 免疫組織化學觀察統(tǒng)計結(jié)果Table 3 The survey results of the immunohistochemical observation

圖3 HP中Runx3呈陽性表達Fig 3 Positive expression of Runx3 in HP(×200)

圖5 TSA中Runx3呈陽性表達Fig 5 Positive expression of Runx3 in TSA(×200)

圖4 SSA/P中Runx3呈陽性表達Fig 4 Positive expression of Runx3 in SSA/P(×200)

圖6 CRC呈陽性表達Fig 6 Positive expression of Runx3 in CRC(×200)

2.4 Runx3基因甲基化與Runx3蛋白相關(guān)性分析

經(jīng)統(tǒng)計學分析顯示：SSA/P、TSA和CRC 3組中Runx3甲基化與Runx3蛋白表達結(jié)果具有相關(guān)性(Plt;0.05)，并且為負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為γ=-0.724、γ=-0.655和γ=-0.782；而正常結(jié)直腸黏膜組織和HP兩組中Runx3甲基化與Runx3蛋白表達結(jié)果不具有相關(guān)性(表4，5)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)HP、SSA/P和TSA中均有Runx3啟動子CpG島甲基化，甲基化率為17.2%(5/29)、51.7%(15/29)、63.2%(12/19)；而14例CRC中有11例Runx3基因CpG島甲基化，甲基化率為85.7%(12/14)；正常組織中Runx3啟動子CpG島甲基化率為12.5%(2/16)。Kodach等[11]在57.4%(27/47)CRC患者中檢測到Runx3基因表達下調(diào)或缺失，其中在85.2%(23/27)CRC組織中檢測到Runx3基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化，而在相對應(yīng)的正常腸組織中未發(fā)現(xiàn)Runx3基因甲基化，說明啟動子區(qū)域的高甲基化導致Runx3基因表達明顯下調(diào)。袁權(quán)利等[12]也發(fā)現(xiàn)53.3%(16/30)的CRC組織中存在Runx3基因CpG島甲基化，正常組織中未發(fā)現(xiàn)。但Waki等研究來源于小腸、大腸、胃等不同器官或組織的甲基化相關(guān)基因如Runx3、E-cadherin、GSTP1、DAP-kinase、P16、MLH1等發(fā)現(xiàn)42歲以后的個體基因啟動子CpG島均以組織特異性的方式發(fā)生不同程度的甲基化。我們研究中CRC的甲基化率與已有研究結(jié)果基本符合，正常組織中檢測到2例存在甲基化，與Waki的研究相吻合，甲基化率的不同可能與樣本量、樣本來源、引物設(shè)計及檢測方法有關(guān)。至今，國內(nèi)外尚無對鋸齒狀病變中Runx3基因甲基化的研究，在我們的研究中，SSA/P、TSA、CRC和正常組及HP組之間有顯著性差異(Plt;0.05)，這3種病變中Runx3基因的甲基化陽性率明顯高于正常組和HP組，且甲基化陽性率在正常、HP、SSA/P、TSA 和CRC組呈遞增趨勢，推測病變惡變程度越高，Runx3基因的甲基化陽性率越高，從而進一步推測Runx3基因甲基化在鋸齒狀通路中起推動作用。

有研究者[13]應(yīng)用MSP技術(shù)對人結(jié)腸癌細胞系進行檢測，發(fā)現(xiàn)50%的人結(jié)腸癌細胞系Runx3蛋白表達下降或不表達。國外有文獻報道[14]通過免疫組織化學方法比較發(fā)現(xiàn)HP和TSA中Runx3的陽性表達較正常結(jié)腸組織和管狀腺瘤(Tubular adenoma，TA)中有所下降。本研究中HP、SSA/P和TSA中Runx3蛋白陽性表達率分別為65.5%(19/29)、48.3%(14/29)、31.6%(6/19)，正常結(jié)腸黏膜Runx3蛋白陽性表達率達81.3%(13/16)，而CRC中Runx3蛋白陽性表達率只有14.3%(2/14)。SSA/P、 TSA和CRC組Runx3蛋白陽性表達率明顯低于HP組及正常組，顯著性差異(Plt;0.05)。由此推論，Runx3蛋白表達下調(diào)或缺失是鋸齒狀病變惡變進展過程中的一個早期事件，與CRC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

表4 正常黏膜組織和HP組中Runx3蛋白表達與Runx3的甲基化Table 4 The expression of the Runx3 protein and gene methylation in normal mucosa tissues and HP

表5 SSA/P、TSA和CRC 3組中Runx3蛋白的表達與Runx3的甲基化Table 5 The expression of the Runx3 protein and gene methylation in SSA/P、TSA and CRC

對Runx3甲基化與Runx3蛋白表達結(jié)果進行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示在SSA/P、TSA和CRC中Runx3甲基化與Runx3蛋白表達具有相關(guān)性(Plt;0.05)，且為負相關(guān)，而正常結(jié)直腸黏膜組織和HP中Runx3甲基化與Runx3蛋白表達結(jié)果不具有相關(guān)性。實驗結(jié)果表明：在SSA/P、TSA和CRC中Runx3基因CpG島甲基化導致Runx3基因表達沉默，從而導致Runx3蛋白表達下調(diào)或缺失。可推測，在鋸齒狀通路中，Runx3基因CpG島甲基化推動了SSA/P和TSA向CRC的惡變；Runx3基因CpG島發(fā)生甲基化是從HP開始，提示我們HP也具有的一定的惡變潛能，需引起臨床病理醫(yī)生的關(guān)注。

綜上所述，Runx3基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化導致Runx3基因表達下調(diào)或缺失，與鋸齒狀病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在鋸齒狀通路中起重要作用，是CRC發(fā)生早期分子事件。

[1] Snover DC. Update on the serrated pathway to colorectal carcinoma[J]. Hum Pathol, 2011,42:1-10.

[2] Makinen MJ. Colorectal serrated adenocarcinoma[J]. Histopathology, 2007,50:131-150.

[3] Chuang LS, Ito Y. RUNX3 is multifunctional in carcinogenesis of multiple solid tumors[J]. Oncogene, 2010,29:2605-2615.

[4] Tong DD, Jiang Y, Li M,etal. RUNX3 inhibits cell proliferation and induces apoptosis by TGF-beta-dependent and-independent mechanisms in human colon carcinoma cells[J]. Pathobiology, 2009,76:163-169.

[5] Peng Z, Tang H, Wang X,etal. Inhibition of the growth and metastasis of human colon cancer by restoration of RUNX3 expression in cancer cells[J]. Int J Oncol, 2008,33:979-984.

[6] HamiltonSR, BosmanFT, BoffettaP. Carcinoma of the colon and rectum. WHO Classification of Tumors of the Digestive System. Pathology and Genetics Tumours and Digestive System[M].4th edition,Switzerland: WHO press, 2010:134-146, 160-165.

[7] Weisenberger DJ, Siegmund KD, Campan M,etal. CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer[J]. Nat Genet, 2006,38:787-793.

[8] 李遇梅, 李政亮, 馬紅, 等. 兩種實時定量PCR方法檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者DNA甲基化狀態(tài)的比較研究[J]. 臨床皮膚科雜志, 2010,39:211-213.

[9] Eads CA, Lord RV, Kurumboor SK,etal. Fields of aberrant CpG island hypermethylation in Barrett’s esophagus and associated adenocarcinoma[J]. Cancer Res, 2000,60:5021-5026.

[10] 許良中, 楊文濤. 免疫組織化學反應(yīng)結(jié)果的判斷標準[J]. 中國癌癥雜志, 1996:229-231.

[11] Kodach LL, Jacobs RJ, Heijmans J,etal. The role of EZH2 and DNA methylation in the silencing of the tumour suppressor RUNX3 in colorectal cancer[J]. Carcinogenesis, 2010,31:1567-1575.

[12] 袁權(quán)利, 李華, 白凈, 等.Runx3基因甲基化與大腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]. 中國綜合臨床, 2007,23:345-347.

[13] Ku JL, Kang SB, Shin YK,etal. Promoter hypermethylation downregulates RUNX3 gene expression in colorectal cancer cell lines[J]. Oncogene, 2004,23:6736-6742.

[14] Subramaniam MM, Chan JY, Soong R,etal. RUNX3 inactivation in colorectal polyps arising through different pathways of colonic carcinogenesis[J]. Am J Gastroenterol, 2009,104:426-436.

Methylation and protein expression ofRunx3 gene in serrated lesion tissues

ZHANG Yu-ping, WANG Lu-ping*, FANG Yuan, XU Chun-wei, GE Chang

(Dept. of Pathology, the General Hospital of Beijing Military Region, Beijing 100700, China)

ObjectiveTo investigate the role and significance of methylation status and protein expression of theRunx3 gene in serrated lesions and carcinogenesis pathway.MethodsTheRunx3 gene promoters methylation were detected with the Taqman probe based real-time PCR(Methylight) technology in 77cases serrated lesions(29 cases of hyperplastic polyps, 29 cases of sessile serrated adenoma/polyp and 19 traditional serrated adenoma), 16 cases of normal mucosa tissues and 14 cases of colorectal cancer. At the same time, immunohistochemical staining was utilized to detect the expression of Runx3, and to analyze the relationship of them.ResultsThe rates of methylation of theRunx3 gene in normal mucosa tissues, HP, SSA/P, TSA and CRC were 12.5%(2/16),17.2%(5/29),51.7%(15/29),63.2%(12/19) and 78.6%(11/14).The results of Immunohistochemistry showed that the positive expression of Runx3 in normal mucosa tissues, HP, SSA/P, TSA and CRC were 81.3%(13/16), 72.2%(21/29), 48.3%(14/29), 31.6% (6/19)and 21.4%(3/14). The Runx3 methylayion was negatively correlated with the expression of Runx3 protein in SSA/P, TSA and CRC (Plt;0.05).ConclusionsRunx3 gene promoter region methylation explains the down-regulation of Runx3 protein expression, which may function in the main reasons for the serrated lesions and occurrence of serrated adenoma and cancer.

DNA methylation;Runx3 gene; serrated lesions;immunohistochemistry

2013-06-13

2013-10-09

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項基金(2011-5021-02)

*通信作者(correspondingauthor)： BZWLP@yhaoo.com

1001-6325(2014)03-0339-06

研究論文

R 735.3

A