家蠅溶菌酶1基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)

王梅梅，萬 玲，孔令聰，裴志花，劉樹明，馬紅霞，3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)科技學(xué)院，長春130118;3.動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))，長春130118)

雞致病性大腸桿菌是世界范圍內(nèi)影響家禽業(yè)發(fā)展的主要細(xì)菌病之一，可通過呼吸道和消化道傳播，具有難治愈、死亡率高、易復(fù)發(fā)等臨床特點，給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重危害［1－2］。而傳統(tǒng)抗生素的濫用加劇了其耐藥性的不斷產(chǎn)生，導(dǎo)致疾病不能被有效控制。抗菌肽作為新型藥物，具有廣譜、高效的抗菌活性，尤其是對耐藥致病菌有良好的殺滅作用［3］。家蠅長期處在惡劣的環(huán)境中，其體表攜帶多種病原體，而自身卻不感染，是緣于其體內(nèi)存在的一種肽類生物活性物質(zhì)即抗菌肽［4］。家蠅溶菌酶作為家蠅抗菌肽的重要成員對耐藥菌株有明顯的殺傷作用，且對正常生物體細(xì)胞無破壞作用［5］。本研究以雞致病性大腸桿菌誘導(dǎo)家蠅三日齡幼蟲抑制性消減文庫中篩選出來的差異基因為基礎(chǔ)，通過對家蠅溶菌酶1基因進(jìn)行克隆及原核表達(dá)，為進(jìn)一步研究其表達(dá)產(chǎn)物抗雞致病性大腸桿菌的活性及其他免疫學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清文庫、菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌誘導(dǎo)家蠅幼蟲SSH文庫由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理實驗室完成，大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α、BL21、原核表達(dá)載體pET－32a(+)均由本實驗室保存。雞致病性大腸桿菌為臨床分離的耐藥菌株，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理實驗室留存。

1.1.2 試劑 Ex TaqTMDNA 聚合酶、EcoR I和BamH I限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、IPTG、DL 2000TMDNA Marker、λ － Hind III digest DNA Marker、pMD18－T載體試劑盒等，購自寶生物工程(大連)有限公司;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物(上海)工程有限公司;cDNA末端快速擴(kuò)增試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 MdL1基因的篩選 通過雞致病性大腸桿菌誘導(dǎo)3日齡家蠅幼蟲，激活家蠅幼蟲免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生差異基因，利用SSH技術(shù)構(gòu)建了雞大腸桿菌誘導(dǎo)家蠅幼蟲的正向、反向cDNA文庫，以PCR法和反向Northern點雜交法進(jìn)行兩次篩選，獲取差異表達(dá)基因部分序列［4］。

1.2.2 家蠅幼蟲總 RNA的提取及 cDNA的合成以三日齡家蠅幼蟲為試驗材料，用蘸有高致病性大腸桿菌菌液的誘導(dǎo)針刺幼蟲腹部，誘導(dǎo)后放于智能人工氣候箱中培養(yǎng)，用于總RNA的提取;總RNA的提取過程參照RNAisoTMPlus提取試劑盒說明書完成，并進(jìn)行mRNA的分離及濃縮;然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成單鏈3’－RACE－Ready cDNA和5’－RACE－Ready cDNA，操作過程參照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說明書完成［4］。

1.2.3 cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE) 根據(jù)大腸桿菌誘導(dǎo)家蠅三日齡幼蟲SSH文庫［4］中篩選得到的MdL－1基因部分cDNA序列設(shè)計5’RACE和3’RACE特異性引物，GSP1:5’－ TCCAGCCTTGTTGGG ACTTGATCTTG －3’，GSP2:5’－ TGCCACTTGTCCTGTGACGCTTTGT －3’，送上海生工生物工程有限公司合成。擴(kuò)增3’RACE和5’RACE按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書進(jìn)行［4］。RACE擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將酶切驗證為陽性的重組質(zhì)粒測序分析。

1.2.4 MdL1全長基因擴(kuò)增及克隆 根據(jù)擴(kuò)增的3’RACE和5’RACE序列拼接得到完整的cDNA序列，并查找其ORF序列。根據(jù)該ORF序列設(shè)計特異性引物MdL1F和MdL1R，并于兩5’端分別添加BamH I和EcoRⅠ酶切位點，MdL1F:5’－TCCGGATCCATGAAATTCTTCATTGTC －3’;MdL1R:5’－CGCGGAAT TCTTAA ACACAATCGTTG －3’。以三日齡家蠅幼蟲5’－RACE－Ready cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α，將雙酶切驗證為陽性的重組質(zhì)粒，送生物公司測序并進(jìn)行序列分析。該重組質(zhì)粒命名為pMD18－T－MdL－1。

1.2.5 MdL－1基因的序列測定及生物信息學(xué)分析測序后的MdL－1基因利用ExPASy網(wǎng)站(http//:expasy.org)提供的ProtParam軟件進(jìn)行理化性質(zhì)分析，利用 NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)進(jìn)行BLASTX分析，分析其功能區(qū)域及與Genbank中所登錄的序列的同源性。

1.2.6 pET－32a－ MdL1表達(dá)載體的構(gòu)建 重組質(zhì)粒pMD18－T－MdL－1和pET－32a(+)經(jīng)EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切回收后，連接并轉(zhuǎn)化至Ecoli BL21(DE3)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將獲得的陽性質(zhì)粒送去測序。將重組質(zhì)粒命名為pET－32a－MdL－1。

1.2.7 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS－PAGE分析將pET－32a－MdL－1陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，挑取單菌落接種于含Amp的5 mL液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜后，取3 mL接種于300 mL液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值在0.6～0.8之間，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)菌液進(jìn)行超聲波破碎后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳。

1.2.8 融合蛋白的親和純化及復(fù)性 用包涵體裂解液(50 mmol/L Tris－Hcl buffer，8 mmol/L urea，pH 8.0)裂解包涵體沉淀，室溫振蕩1～2 h，4℃ 12000 r/min離心30 min，收集上清，進(jìn)行純化，操作過程參照GE healthcare的His TrapTMHP說明書進(jìn)行［6］。將純化液裝入透析袋中，4℃于復(fù)性緩沖溶液中進(jìn)行尿素梯度透析。

1.2.9 生物活性檢測 收集復(fù)性蛋白，利用牛津杯法，檢測融合蛋白對大腸桿菌的生物活性［7］。取100 μL大腸桿菌菌液(105CFU/mL)均勻涂布于瓊脂平板上，放入牛津杯，杯內(nèi)加入100 μL蛋白，37℃過夜培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 MdL1基因的篩選 將部分序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對分析后，篩選得到一個家蠅溶菌酶1基因。

2.2 家蠅幼蟲總RNA的提取、純化與質(zhì)量鑒定提取得到家蠅幼蟲總RNA后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，總RNA有2條清晰條帶，28S rRNA和18S rRNA，一條較淺的 5S rRNA條帶(圖1)，OD260/OD280為1.98，提取、純化的家蠅幼蟲總RNA可滿足實驗要求。

圖1 總RNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 RACE擴(kuò)增MdL1基因 PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖電泳顯示，3’－RACE得到大約為350 bp的片段，5’－RACE得到大約為450 bp的片段(圖2)。重組質(zhì)粒pMD18－T－3R和pMD18－T－5R經(jīng)酶切驗證，結(jié)果顯示獲得的條帶與RACE PCR擴(kuò)增得到的條帶大小相符(圖3)。

圖2 MdL-1基因的3'和5'RACE擴(kuò)增結(jié)果

圖3 MdL-1基因3’R和5’R重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.4 MdL1全長基因的克隆 根據(jù)3’RACE和5’RACE序列拼接得到大小為537 bp的全長序列。MdL－1基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到一條約為432 bp的片段。pMD18－T－MdL1重組質(zhì)粒酶切驗證顯示，獲得的條帶與432 bp大小相符(圖4)。

圖4 MdL1基因ORF擴(kuò)增結(jié)果和pMD18T-MdL-1雙酶切鑒定圖

2.5 序列分析 該基因全長為537 bp，ORF為432 bp，編碼144個氨基酸，預(yù)測分子量為15.9 kD，等電點(pI)5.17。該序列與GenBank上部分核苷酸進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，與家蠅溶菌酶1基因的mRNA全序列(AY344589.1)同源性為96%。運用NCBI的CDD程序?qū)dL－1基因編碼蛋白的保守區(qū)域進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示擴(kuò)增的MdL－1基因編碼的蛋白質(zhì)與溶菌酶家族保守區(qū)域一致(圖5)，并依此確定該基因為家蠅溶菌酶1基因。

2.6 pET－32a－MdL－1表達(dá)載體的構(gòu)建 pET－32a－MdL－1重組質(zhì)粒雙酶切后，獲得大小約為435 bp和5900 bp的片段(圖6)，分別為MdL－1和pET－32a(+)。表明MdL－1基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 MdL-1的保守結(jié)構(gòu)域

2.7 材料重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析 MdL1的理論分子量約為15.9 kD，pET－32a(+)載體具有Trx標(biāo)簽蛋白，分子量約為18.4 kD。經(jīng)過SDS－PAGE電泳檢測，與空白對照菌株比較，在預(yù)期位置34 kD大小附近出現(xiàn)目的蛋白條帶，超聲波破碎后，電泳檢測發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白主要存在于沉淀中，以包涵體的形式存在，屬于不溶性表達(dá)(圖7)。

圖6 MdL-1基因全長質(zhì)粒重組體酶切鑒定結(jié)果

圖7 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-MdL-1在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析

2.8 融合蛋白的純化 純化后的蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測，得到分子量約為34 kD的融合蛋白條帶(圖8)。

圖8 純化目的蛋白Trx-6His-MdL1

2.9 生物活性檢測 實驗以包涵體洗脫液為對照和純化蛋白進(jìn)行抑菌效果比較(圖9)。

圖9 純化蛋白對大腸桿菌的抑菌試驗

由圖9可見，蛋白1對大腸桿菌的抑菌圈直徑為11mm，而空白對照2沒有抑菌圈，說明融合蛋白對大腸桿菌有一定的抑菌作用。

3 討論

家蠅抗菌肽作為新型抗菌藥物研究主要集中在家蠅防御素［8－9］、家蠅攻擊素［10］、家蠅天蠶素［9］等方面，而對于家蠅溶菌酶的研究較少［11］，對家蠅溶菌酶研究較多的是其消化作用方面［12］。Chimoy等從家蠅體內(nèi)克隆得到溶菌酶基因MdL1(AY344589)和一條不完全的溶菌酶基因片段MdL2(AY344588)，Cancado等利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對MdL1和MdL2基因進(jìn)行了重組表達(dá)并研究，認(rèn)為這兩種溶菌酶均與消化密切相關(guān)［13］。本文是對其抗菌活性和免疫活性進(jìn)行研究。家蠅溶菌酶是生物體中非特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)物，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的殺菌活性。本研究利用RACE技術(shù)，在5’和3’末端設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增出MdL1全長序列，與傳統(tǒng)的克隆全長cDNA方法相比，不僅靈敏度高、特異性好、時間周期短，而且操作簡單易懂［14］。MdL－1具有Lysozyme 1家族保守區(qū)域，其 ORF與GenBank中登錄號為AY344589.1家蠅溶菌酶1基因同源性最高，達(dá)96%，存在5個氨基酸的差異。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、外源基因表達(dá)產(chǎn)物水平高、培養(yǎng)周期短等特點，多被用于表達(dá)家蠅抗菌肽基因［15］。家蠅抗菌肽本身具有抗菌作用，在細(xì)菌中直接表達(dá)可能對宿主菌產(chǎn)生殺傷作用，因此多采用融合表達(dá)方式進(jìn)行表達(dá)。pET－32a表達(dá)載體具有硫氧還蛋白(Trx)基因和6個組氨酸殘基基因，可降低其對宿主菌的殺傷作用，提高目的蛋白表達(dá)量。本實驗構(gòu)建了家蠅溶菌酶1基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET－32a－MdL－1，并在大腸桿菌BL21中獲得表達(dá)，蛋白主要以包涵體形式存在，避免了蛋白酶對其的降解作用，并且包涵體中雜蛋白含量較低。生物活性試驗結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物對大腸桿菌具有一定的殺菌作用，為進(jìn)一步研究MdL－1抗雞致病性大腸桿菌活性及開發(fā)一種廣譜高效的新型抗菌藥物奠定了基礎(chǔ)。

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