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      HPLC-MS/MS法檢測(cè)豬肉中苯并菲啶類生物堿的研究

      2014-11-29 08:08:32馮宋崗曾建國
      中國獸藥雜志 2014年4期
      關(guān)鍵詞:白屈菜博落回質(zhì)譜

      馮宋崗,曾建國

      (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心,長(zhǎng)沙410128)

      博落回(Macleaya cordata(willd.)R.Br)隸屬罌粟科,多年生草本植物,廣泛分布于我國的湖南等?。?]。血根堿(Sanguinarine,SA)與白屈菜紅堿(Chelerythrine,CHE)[2]為其主要活性成分之一。SA和CHE屬于季胺苯并菲啶類生物堿(QBAs),是芐基異喹啉類生物堿中的一類[3-4],具有抑菌[5-6]、抗炎[7]等效果。在歐洲,博落回提取物(Sangrovit?)已作為植物源性飼料添加劑使用多年[8]。在我國,博落回散已成功地被開發(fā)為我國第一個(gè)二類新中獸藥,并作為首個(gè)中獸藥藥物飼料添加劑批準(zhǔn)使用,可視為后抗生素時(shí)代為解決飼用抗生素替代技術(shù)和產(chǎn)品。本研究以飼喂添加博落回散的飼料的豬為研究對(duì)象,對(duì)其中SA和CHE的藥物殘留檢測(cè)前處理?xiàng)l件和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)豬肉中SA和CHE藥物殘留的方法,并為進(jìn)一步驗(yàn)證博落回散作為藥物飼料添加劑使用的安全性研究提供方法借鑒。

      1 材料和方法

      1.1 材料與試劑 甲酸(質(zhì)譜級(jí),上海安譜科學(xué)儀器有限公司);甲醇(色譜純,Merk,Darmstadt,Germany);鹽酸(分析級(jí),國藥集團(tuán));乙腈(色譜純,Merk,Darmstadt,Germany);水(Milli- Q);正己烷(分析級(jí),國藥集團(tuán))。血根堿對(duì)照品(批號(hào):201101,中國藥品生物制品檢定所),白屈菜紅堿(批號(hào):111718-200501,中國藥品生物制品檢定所)。博落回散(批號(hào):1303023,湖南美可達(dá)生物資源有限公司,規(guī)格:血根堿≥1.5%)。豬肉:實(shí)驗(yàn)組為以博落回散作飼料添加劑的飼料(每噸添加博落回散40 g)飼喂90 d后屠宰采集;空白對(duì)照為不飼喂添加博落回散的豬肉樣品。

      1.2 儀器 高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)(美國 Agilent公司,6460型);Milli-Q Advantage A10系統(tǒng)(美國 MILLPORE公司);KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);ML204/02型精密天平(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司);渦旋混勻器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;低溫高速離心機(jī)(Hermle公司);氮吹儀(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)。

      1.3 方法

      1.3.1 對(duì)照品溶液制備 對(duì)照品稱重前在干燥器中干燥,精密稱取血根堿、白屈菜紅堿各10 mg,置于100 mL容量瓶中,加入甲醇溶解定容配制得0.1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,將儲(chǔ)備液甲醇稀釋1000倍,制得血根堿和白屈菜紅堿均為100 ng/mL,保存于4℃。

      1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取豬肌肉1 g于50 mL的離心管中,加超純水2 mL,勻漿機(jī)勻漿,加入1%鹽酸-甲醇(10∶90,V/V)溶液15 mL,渦旋3 min,超聲萃取 20 min,10000 r/min冷凍離心10 min,上清液移入另一50 mL的離心管中;沉淀物加10 mL 1%鹽酸-甲醇(10∶90,V/V)溶液按上述方法提取,重復(fù)兩次;將三次提取的上清液合并,加10 mL正己烷脫脂,渦旋2 min,10000 r/min冷凍離心2 min,棄去上層正己烷相,剩余液體在50℃水浴下氮?dú)獯蹈?,? mL甲醇復(fù)溶,12000 r/min冷凍離心10 min,上清液過0.22 μm 有機(jī)膜;待供試液。

      1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC C18(2.1 mm ×150 mm,2.7 μm);流動(dòng)相A 為0.2%甲酸溶液,流動(dòng)相B 為乙腈;梯度洗脫:0~8 min,28% ~50%B;8~16 min,50% ~28%B;柱溫 35 ℃;流速 0.3 mL/min;進(jìn)樣量 2 μL。

      離子源:電噴霧離子源(ESI);毛細(xì)管電壓:4 kV;離子源溫度:300℃;EMV:200 V;正離子模式;脫溶劑氣和霧化氣為高純氮?dú)?,脫溶劑氣溫?350℃;脫溶劑氣流量:10 L/min;霧化氣壓力:45 psi;檢測(cè)方式:多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);碰撞能量、定性離子對(duì)及定量離子對(duì)等參數(shù)見表1。

      表1 血根堿和白屈菜紅堿的色譜保留時(shí)間和定性、定量離子參數(shù)

      2 結(jié)果與分析

      2.1 線性關(guān)系考察和定量限 精密量取100 ng/mL的對(duì)照品溶液 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻。按照上述1.3.3項(xiàng),測(cè)定 SA和 CHE的峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程分別為血根堿Y=489.87X - 107.87 ,R2=0.9996 ,白屈菜紅堿Y=1101.2X -192.35 ,R2=0.9995 ,結(jié)果表明SA 和CHE質(zhì)量濃度在0.5~50 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋,按照上述1.3.3項(xiàng)對(duì)稀釋樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度S與背景信號(hào)強(qiáng)度N的比值,即信噪比,當(dāng)S/N=10時(shí)樣品的最低濃度為最低定量限。經(jīng)測(cè)定,本方法SA和CHE的定量限分別為0.01 ng/mL和0.04 ng/mL。

      2.2 重復(fù)性和精密度 精密稱取同一頭豬同一部位肌肉6份,按照1.3.2項(xiàng)制備供試品溶液,并按照1.3.3項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)分析,計(jì)算得到豬肉中SA和CHE的平均含量為4.75 ng/g和2.10 ng/g。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD/%)為11.68%和9.90%,結(jié)果表示該方法重復(fù)性良好,取供試液一份,按1.3.3項(xiàng)方法連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,計(jì)算得SA、CHE的平均含量分別為為5.22 ng/g,2.35 ng/g,RSD 分別為2.58%和3.89%,表明儀器的精密度良好。

      2.3 方法的專屬性 分別設(shè)置空白豬肉樣品組、空白豬肉樣品加SA和CHE對(duì)照品組、飼喂添加了博落回散的豬肉樣品組。按1.3.2項(xiàng)對(duì)三組樣品分別制備供試液,并按1.3.3項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖1、圖2、圖3、圖4所示,通過圖可以看出,SA、CHE峰型良好,且在豬肉中無內(nèi)源性物質(zhì)的干擾??瞻棕i肉樣品組未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰,表明該方法的專屬性較好。

      圖1 空白豬肉樣品加SA和CHE對(duì)照品組色譜圖

      圖2 飼喂添加了博落回散的豬肉樣品組色譜圖

      圖3 血根堿的子離子質(zhì)譜圖

      圖4 白屈菜紅堿的子離子質(zhì)譜圖

      2.4 回收率測(cè)定 在豬肉樣品中添加SA、CHE標(biāo)準(zhǔn)溶液,按 1.3.2 項(xiàng)制備供試品溶液,按 1.3.3 項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)分析,對(duì)豬肉樣品進(jìn)行3個(gè)含量水平的加樣回收實(shí)驗(yàn)(每個(gè)加標(biāo)濃度測(cè)3個(gè)平行樣),3個(gè)含量水平分別為8、10、12 ng/g。結(jié)果如表2所示,從表2可以看出,本方法SA的回收率在88.5% ~94.1%之間,平均回收率為91.5%,CHE的回收率在87.9% ~93.4%,平均回收率為 91.3%,表明方法具有較好的準(zhǔn)確度。

      表2 SA和CHE加標(biāo)回收率

      2.5 樣品檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組豬各6頭,屠宰取樣,每份樣品做兩個(gè)平行,按照1.3.2項(xiàng)制備供試品溶液,按1.3.3項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)分析,平行樣本取平均值,結(jié)果見表3。由表3可以看出,血根堿和白屈菜紅堿在6頭豬的肌肉中的平均殘留量為4.76 ng/g和 2.09 ng/g。

      表3 豬肌肉中SA、CHE殘留量檢測(cè)結(jié)果 ng/g

      3 討論與小結(jié)

      近年來,食源性動(dòng)物產(chǎn)品的食品安全問題已成為社會(huì)的一個(gè)焦點(diǎn)問題,藥物使用過程中違禁或超規(guī)定劑量使用藥物,及添加未標(biāo)示藥物成分等違規(guī)添加和濫用的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。中獸藥作為近幾年發(fā)展起來的全新方向,其有效活性成分也主要是植物次生代謝產(chǎn)物如生物堿、黃酮等,因此,對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)的殘留進(jìn)行前瞻性的深入研究,進(jìn)一步詮釋其作為飼料添加劑的安全性很有必要。

      因血根堿本身帶正電荷對(duì)質(zhì)譜離子源有一定的污染,研究過程中,發(fā)現(xiàn)空白樣品有時(shí)也有極低的陽性響應(yīng),因此需要每次檢測(cè)前進(jìn)空白溶劑,驗(yàn)證儀器系統(tǒng)沒有被污染,每次檢測(cè)結(jié)束后,對(duì)離子源進(jìn)行仔細(xì)清理。本研究對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)1%鹽酸-甲醇(10∶90,V/V)的提取和沉淀蛋白效果最好,重復(fù)三次的提取能夠很大程度的提高加樣回收率。

      本實(shí)驗(yàn)以SA和CHE為測(cè)試對(duì)象,通過對(duì)樣品前處理?xiàng)l件及HPLC-MS/MS檢測(cè)條件的優(yōu)化,建立了豬肉中QBAs殘留量的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法。該方法具有前處理較為簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),靈敏度及定量準(zhǔn)確高和專屬性強(qiáng)等特點(diǎn),方法學(xué)驗(yàn)證的各項(xiàng)指標(biāo)均可達(dá)到實(shí)際樣品的檢測(cè)要求,可用于豬肉中痕量QBAs的殘留檢測(cè)。

      [1] 中國科學(xué)院中國植物志編委會(huì).中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1999:78.

      [2] 孫麗艷,魏雄輝,韋 宇.博落回總生物堿提取方法的研究[J].藥物分析雜志,2003,23(1):15-18.

      [3] Pavel Kosina,Daniela Walterova,Jitka Ulrichovaet,et al.Sanguinarine and chelerythrine:assessment of safety on pigs in ninety days feeding experiment[J].Food & Chemical Toxicology,2004,42(1):85 -91.

      [4] Kosina P,Pavel Kosina,Jan Vacek,et al.Identification of benzo[c]phenanthridine metabolites in human hepatocytes by liquid chromatography with electrospray ion-trap and quadrupole time- of- flight mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B,2011,879(15/16):1077-1085.

      [5] 趙東亮,郁建平,周曉秋,等.博落回生物堿的抑菌作用研究[J].食品科學(xué),2005,26(1):45 -47.

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