申貴雋 魏婷 趙婷

（大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連116622）

0 前言

磷對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響。磷是作物體內(nèi)脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）的組成成分。這些有機(jī)磷化合物對(duì)作物的生長(zhǎng)與代謝起重要作用。正常的磷素營(yíng)養(yǎng)有利于核酸與核蛋白的形成，加速細(xì)胞的分裂與增殖，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)體的生長(zhǎng)，尤其在作物生長(zhǎng)早期，充足的磷素營(yíng)養(yǎng)尤為重要，生長(zhǎng)前期作物吸收的磷，可以再利用，參與新生組織的形成與代謝。磷與水稻植株體內(nèi)糖、氮和脂肪代謝有密切關(guān)系；磷參與能量代謝，它在細(xì)胞質(zhì)中迅速酯化形成腺苷一磷酸（AMP）、腺苷二磷酸（ADP）和腺苷三磷酸（ATP）。土壤供磷不足，既影響植物的光合作用和呼吸作用及生物合成過(guò)程等，也影響植物細(xì)胞分裂、新細(xì)胞形成及細(xì)胞伸長(zhǎng)，使植株瘦小，分枝減少。施磷肥能促進(jìn)水稻作物的CO同化和蛋白質(zhì)合成，稻株的生長(zhǎng)正常籽粒重量增加，從而提高產(chǎn)量。在作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效栽培中，磷對(duì)養(yǎng)分協(xié)調(diào)供應(yīng)，也有不可取代的作用［1］。

土壤中總磷含量的測(cè)定方法主要以鉍磷鉬藍(lán)分光光度法為主［2］，該方法操作簡(jiǎn)便、分析成本低、顯色穩(wěn)定、選擇性好、靈敏度高、干擾少，但儀器攜帶不方便，一般用于實(shí)驗(yàn)室分析。因此，磷含量測(cè)定方法的簡(jiǎn)單化、便捷化且易推廣化對(duì)監(jiān)測(cè)部門(mén)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。如今，數(shù)碼相機(jī)具有強(qiáng)大的功能、操作便捷和出色的拍攝效果等優(yōu)點(diǎn)，在納米材料的表征、生物學(xué)研究、藥材的顯微鑒定［3－4］、土壤形態(tài)分析及考古學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。由于數(shù)碼相機(jī)不能分光，使其在分析化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用很少。數(shù)碼成像是基于CCD電荷耦合器件記錄影像，再把CCD器件的電子信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)［5］?；赗GB原理，Maleki利用數(shù)碼成像建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)［6］，把數(shù)碼相機(jī)作為檢測(cè)器用于酸堿滴定分析，取得了較好的效果。由此可見(jiàn)，數(shù)碼成像已經(jīng)被逐漸運(yùn)用于分析化學(xué)研究中。所以，本研究在有效避免光的反射、側(cè)光及投影的情況下利用自然光使標(biāo)準(zhǔn)試樣和待測(cè)樣品成像，再基于RGB原理定量分析土壤中的總磷的含量。此方法簡(jiǎn)便，快捷，并且用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

UV－2102PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（浙江華南儀器設(shè)備有限公司），1XUS 310HS型佳能相機(jī)。

鉬酸鹽、磷酸二氫鉀（KH2PO4，鄭州派尼化學(xué)試劑有限公司），硫酸、氫氧化鈉、酚酞和抗壞血酸（廣州化學(xué)試劑有限公司）。

磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100mg／L的磷酸二氫鉀）。所用試劑均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 土壤樣品的預(yù)處理

將土壤樣品研磨，用篩孔尺寸為0.250mm的篩子篩取試樣，風(fēng)干之后準(zhǔn)確稱取樣品0.25g（精確至0.000 1g），小心放入坩堝底部，加入無(wú)水乙醇3～4滴，潤(rùn)濕樣品，在樣品上平鋪2.0g的氫氧化鈉，將干鍋放入高溫電爐，升溫，當(dāng)溫度升至200℃左右，切斷電源，暫停15min，然后繼續(xù)升溫至300℃，并保持15min，取出冷卻，加入10mL約80℃的水，同時(shí)用H2SO4（3mol／L）溶液和去離子水，多次洗坩堝，洗滌液也一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，冷卻，定容待熔塊溶解后，用無(wú)磷定量濾紙過(guò)濾或離心澄清，定容至100mL，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3 磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別配制成濃度為0.00，31.51，34.84，48.54，53.45，64.39mg／L 的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在6個(gè)50mL燒杯中加等量的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，另外再在1個(gè)燒杯中加等量的去離子水作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

在以上6個(gè)燒杯中分別加入1滴酚酞指示劑，滴加NaOH至剛呈微紅色，再滴加H2SO4溶液使微紅色剛好褪去，充分混合，用水稀釋至刻度。

加入1.0mL抗壞血酸溶液混勻，30s后加2.0mL鉬酸鹽溶液充分混勻。

室溫下放置10min用簡(jiǎn)單模式直接數(shù)碼成像，如圖1所示。由圖1得知溶液顏色隨著磷酸二氫鉀溶液濃度的增加逐漸變淺。

1.5 Photoshop軟件讀取RGB值

1）文件——打開(kāi)——選取實(shí)驗(yàn)圖片，軟件截圖如圖2所示。

2）選取圖片顏色分布比較均勻的地方，點(diǎn)擊工具欄最下方的顏色圖標(biāo)，出現(xiàn)如截圖3所示。

3）記錄圖片的RGB值得出表1所示不同濃度下磷酸二氫鉀的三原色對(duì)照值［7］。

1.6 濃度計(jì)算程序編譯依據(jù)及軟件應(yīng)用

1.6.1 濃度計(jì)算程序編譯依據(jù)

由文獻(xiàn)查得RGB與灰度Gray（Gr）之間的通用關(guān)系式：Gr＝R×0.3＋G×0.59＋B×0.11［8］。

利用Excel分別將 R（紅色），G（綠色），B（藍(lán)色）擬合成與濃度C的關(guān)系：

R＝1.12C＋21.1；G＝0.9C＋91.1；

B＝1.09C＋129.2

利用以上公式可得灰度Gray與濃度C之間的關(guān)系：

Gr＝0.986C＋73.14

1.6.2 軟件應(yīng)用

將此濃度計(jì)算軟件安裝到手機(jī)上，運(yùn)行并打開(kāi)窗口［9］。

用Photoshop軟件讀取實(shí)驗(yàn)圖片的RGB值，代入濃度計(jì)算軟件點(diǎn)擊確定即可。窗口截圖如圖4。

圖1 不同濃度下溶液顏色的變化Figure 1 Solution color changes with different solution concentrations.

圖2 Photoshop打開(kāi)圖片的軟件界面Figure 2 Software interface for using Photoshop to open a picture file.

圖3 Photoshop讀取圖片RGB值的軟件界面Figure 3 Software interface for using Photoshop to read RGB value of a picture.

圖4 濃度計(jì)算窗口Figure 4 Concentration calculation window.

圖5 樣品溶液的顏色變化Figure 5 Color changes of the sample solution.

1.7 試劑包

由于該方法適用于現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定土壤中總磷含量，因此此方法將測(cè)定過(guò)程需要的藥品由試劑包A和試劑包B組成。

試劑包A：①無(wú)水乙醇，②氫氧化鈉，④去離子水，③硫酸溶液。主要用于土壤樣品的預(yù)處理。

試劑包B：①酚酞指示劑，②NaOH溶液，③H2SO4溶液，④抗壞血酸，⑤鉬酸鹽溶液。主要用于土樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色反應(yīng)。

使用順序：先A后B。

2 樣品測(cè)定

2.1 土壤樣品的測(cè)定

分別準(zhǔn)確吸取兩份待測(cè)樣品溶液2～10mL于兩個(gè)50mL容量瓶中，用水稀釋至總體積的3／5處，分別加1滴酚酞指示劑，再滴加NaOH至剛呈微紅色，然后滴加H2SO4溶液使微紅色剛好褪去，充分混合，用水稀釋至刻度，加入1.0mL抗壞血酸溶液混勻，30s后加2.0mL鉬酸鹽溶液充分混勻。室溫下放置10min用簡(jiǎn)單模式直接數(shù)碼成像。成像結(jié)果見(jiàn)圖5。最后按實(shí)驗(yàn)步驟依次讀取RGB值、用自編軟件直接讀取總磷含量值（見(jiàn)表2）。

2.2 樣品測(cè)定結(jié)果與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

另取已知含量的樣品溶液兩份，分別加入磷標(biāo)準(zhǔn)溶液使其濃度達(dá)到原樣品濃度的二倍，然后按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其總磷含量并計(jì)算加標(biāo)回收率（結(jié)果見(jiàn)表2）。

2.3 方法精密度與比對(duì)實(shí)驗(yàn)

用磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制成10，20，30，40，50，60，70，80mg／L的磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，顯色后分別測(cè)得其吸光度。經(jīng)回歸分析得知其相關(guān)系數(shù)R＝0.98，線性方程為：A＝－0.023 7C＋1.847 6。

表2 土壤中總磷含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Analytical results for the totalphosphorus of soi

再將磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別配制成濃度為0.00，31.51，34.84，48.54，53.45mg／L 和 64.39mg／L的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述溶液依次分別取兩份，并按照實(shí)驗(yàn)步驟加入顯色劑。一份應(yīng)用前面所述的數(shù)碼比色方法測(cè)定該標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，另一份用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度并代入線性方程求得濃度的對(duì)比測(cè)定值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。兩種方法測(cè)定結(jié)果基本一致。

另取總磷含量為34.84mg／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液做10次平行測(cè)定，結(jié)果表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%。

表3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度的數(shù)碼比色與分光光度法測(cè)定結(jié)果Table 3 Comparison of the analytical results for the standard stock solution using digital colorimetric method and spectrophotometry ／（mg·kg－1）

3 結(jié)論

手機(jī)數(shù)碼比色法測(cè)定土壤中總磷濃度經(jīng)國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證，測(cè)定準(zhǔn)確度能夠滿足環(huán)境樣品的測(cè)試要求，并且此方法與傳統(tǒng)測(cè)定方法相比克服了肉眼對(duì)顏色的分辨率，極大地提高了方法的靈敏度和精密度，發(fā)展了傳統(tǒng)的比色分析技術(shù)，并且此方法方便快捷，容易操作，成本低，能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)分析，是一種農(nóng)民自行測(cè)定土壤中總磷含量的好方法。

［1］中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)總編輯委員會(huì)，農(nóng)業(yè)化學(xué)卷編輯委員會(huì)，中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)編輯部編 .中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)：農(nóng)業(yè)化學(xué)卷［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1996：429－430.

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