河北省北部馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯敏感性的測(cè)定與分析

周園+楊志輝+徐進(jìn)+劉麗麗+朱杰華

摘要：選取2009～2011年采集自河北省張家口、承德兩地的74株馬鈴薯早疫病菌（Alternaria solani），用抑制分生孢子萌發(fā)的方法，進(jìn)行嘧菌酯敏感性測(cè)定，旨在為生產(chǎn)上科學(xué)使用嘧菌酯提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，嘧菌酯的EC50介于0.01～0.13 μg/mL之間，平均EC50為0.04 μg/mL。處于敏感基線的菌株（EC50 0.01～0.07 μg/mL）占總數(shù)的87.84%。2009～2011年所采集的早疫病菌對(duì)嘧菌酯敏感性隨年度略微有所下降，不同地區(qū)采集的菌株對(duì)嘧菌酯的敏感性也有差異。因此，河北省北部地區(qū)馬鈴薯早疫病的防控仍可以使用嘧菌酯，但不可盲目，并實(shí)時(shí)檢測(cè)菌株的抗藥性。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯早疫病菌（Alternaria solani）；嘧菌酯；敏感基線

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）19-4598-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.023

Determination and Analyses of Sensitivity to Azoxystrobin of Alternaria solani from Potato in the Northern Hebei Province

ZHOU Yuan， YANG Zhi-hui， XU Jin， LIU Li-li， ZHU Jie-hua

（College of Plant Protection， Agricultural University of Hebei， Baoding 071000， Hebei， China）

Abstract： Seventy-four isolates of Alternaria solani were collected from Zhangjiakou and Chengde in Hebei province from 2009 to 2011. Sensitivity to azoxystrobin was determined with inhibition of conidial germination methods to provide theoretical basis for the scientific use of azoxystrobin. The results showed that the EC50 values were in the range of 0.01～0.13 μg/mL. The mean of the EC50 value was 0.04 μg/mL. 87.84% of the total strain was sensitive（EC50 values were in the range of 0.01～0.07 μg/mL）. Strains with azoxystrobin sensitivity decreased slightly year by year. There were differences in sensitivity of azoxystrobin for the strains collected in different regions. Prevention and control of potato early blight can still use azoxystrobin in northern Hebei Province. It is advised not to use blindly and to detect strains of drug-resistant of azoxystrobin at any time.

Key words： potato early blight （Alternaria solani）； azoxystrobin； sensitive baseline

馬鈴薯早疫病是由茄鏈格孢（Alternaria solani）引起的馬鈴薯重要真菌病害之一，在世界各國(guó)普遍發(fā)生[1]，且近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，被認(rèn)為是僅次于馬鈴薯晚疫病的第二大病害[2]，該病害在馬鈴薯產(chǎn)區(qū)可造成20%～30%產(chǎn)量損失[3-5]。目前，生產(chǎn)中抗早疫病的馬鈴薯品種少，對(duì)早疫病的防治主要依靠化學(xué)藥劑[6]。嘧菌酯（azoxystrobin），商品名為阿米西達(dá)，是瑞士先正達(dá)公司開(kāi)發(fā)的第一個(gè)商品化的甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑[7]。嘧菌酯對(duì)四大作物致病真菌中大部分病菌都具有很好的控制作用，且對(duì)環(huán)境及非靶標(biāo)生物安全，已成為全球作物病害綜合防控的重要藥劑，截至2001年4月，該藥已在包括中國(guó)在內(nèi)的全球72個(gè)國(guó)家、80余種作物的多種病害防治上獲得登記。

嘧菌酯是一種線粒體呼吸抑制劑，其既能抑制菌絲生長(zhǎng)又能抑制孢子萌發(fā)，并且對(duì)菌物孢子的產(chǎn)生有明顯的抑制作用[8]。該藥劑殺菌譜廣，在馬鈴薯上既可防治由致疫病毒引起的晚疫病，又能防控由真菌引起的早疫病，因此，在馬鈴薯病害化學(xué)防控中具有重要的作用。1999年美國(guó)在馬鈴薯上登記防控早疫病，該藥劑的敏感基線EC50值為0.01～0.07 μg/mL[9]。Pasche等[10，11]在內(nèi)布拉斯加州首次報(bào)道了馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性降低，其EC50值0.25～0.51 μg/mL；次年，北達(dá)科他州和明尼蘇達(dá)州也出現(xiàn)了敏感性降低的菌株。Julie等[12]發(fā)現(xiàn)基因突變的抗性菌株EC50值在0.35 μg/mL以上，且短短5年的時(shí)間內(nèi)，美國(guó)馬鈴薯種植區(qū)抗性菌株的出現(xiàn)頻率高達(dá)96.5%。Chin等[13]研究表明嘧菌酯對(duì)小麥白粉病菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）的敏感性基線EC50值為0.022～0.235 μg/mL，但使用兩年后，在德國(guó)北部三個(gè)地區(qū)監(jiān)測(cè)到抗性個(gè)體，其EC50 10 μg/mL，抗性超過(guò)敏感基線的500倍，且出現(xiàn)抗性頻率高達(dá)90%以上。Vincelli等[14]測(cè)得稻瘟病菌（Pyricularia grisea）測(cè)得嘧菌酯敏感基線EC50出現(xiàn)為0.015～0.064 μg/mL，在每年連續(xù)使用嘧菌酯5～7次，3年后，出現(xiàn)抗性程度超過(guò)敏感基線100倍的抗性菌株，其EC50為2.39～44.80 μg/mL，表明嘧菌酯屬于一類(lèi)抗性風(fēng)險(xiǎn)較大的藥劑。

在中國(guó)，先正達(dá)1999年對(duì)嘧菌酯開(kāi)展了一系列試驗(yàn)研究和示范工作，并于2001年取得登記。但由于嘧菌酯價(jià)格高，農(nóng)民對(duì)早疫病的防控重視程度不夠等原因，該藥劑在我國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)使用量相對(duì)較少。2013年3月，嘧菌酯的專利保護(hù)期已過(guò)，國(guó)內(nèi)一些廠家開(kāi)始陸續(xù)投產(chǎn)嘧菌酯單劑與復(fù)配產(chǎn)品，隨著該藥劑生產(chǎn)總量的上升，價(jià)格下降，又由于該藥劑對(duì)馬鈴薯早疫病的防控效果較好，因此，今后該藥劑可能會(huì)在馬鈴薯早疫病防控上被大量使用。然而，關(guān)于中國(guó)馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性仍不清楚，本試驗(yàn)測(cè)定河北省北部馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，可了解該區(qū)域馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性情況，為今后嘧菌酯抗性監(jiān)測(cè)提供靈敏度基線，對(duì)中國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性基線和抗性風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2009～2011年，在馬鈴薯生長(zhǎng)季采集了河北省張家口、承德地區(qū)11縣馬鈴薯主要種植區(qū)的早疫病發(fā)病葉片樣本，采用單病斑組織分離法，共分離獲得74株馬鈴薯早疫病菌，采樣地點(diǎn)、年份和菌株數(shù)見(jiàn)表1。

1.2 供試藥劑與培養(yǎng)基

25%嘧菌酯（瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）；水楊基氧肟酸（SHAM，Sigma化工有限公司）。馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、番茄汁瓊脂培養(yǎng)基（TA）和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）。

1.3 孢子萌發(fā)法測(cè)定馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性

馬鈴薯早疫病菌菌株活化培養(yǎng)后，取直徑為5 mm 的菌盤(pán)置于番茄汁瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)10 d[15]。用滅菌水將分生孢子從培養(yǎng)基上洗下，過(guò)濾后，制備成1.0×104個(gè)/mL的孢子懸浮液。在含有100 μg/mL水楊基氧肟酸（SHAM）的1.5%水瓊脂[16]中加入嘧菌酯，分別配置成終濃度為0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μg/mL的水瓊脂平板。取50 μL孢子懸浮液均勻涂布在含有不同藥劑濃度的水瓊脂平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)4 h后進(jìn)行顯微觀察。每個(gè)濃度取5個(gè)不同視野，每個(gè)視野隨機(jī)檢測(cè)20個(gè)孢子，記錄孢子萌發(fā)的個(gè)數(shù)，計(jì)算抑制孢子萌發(fā)率，根據(jù)相對(duì)抑制率計(jì)算其EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性分布

馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性分布見(jiàn)圖1。由圖1可知，供試的74株早疫病菌的EC50介于0.01～0.13 μg/mL之間，平均為0.04 μg/mL。其中EC50在平均值以下的菌株有53株，占總數(shù)的71.62%；處于敏感基線的菌株（EC50值0.01～0.07 μg/mL）有65株，占總數(shù)的87.84%。其余12.16%的菌株為敏感性下降的菌株。

2.2 不同年份間馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性分布

不同年份間馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性分布見(jiàn)圖2。由圖2可知，2009～2011年河北省北部馬鈴薯早疫病菌最敏感菌株的EC50幾乎相當(dāng)，均為0.01 μg/mL。但3年中最不敏感菌株的EC50差異明顯，2009年其EC50最低，為0.07 μg/mL；而2011年菌株的EC50最高，為0.13 μg/mL，且這3年的菌株分別集中分布在0.02、0.03、0.04 μg/mL附近。這表明雖然河北省北部馬鈴薯早疫病菌仍為敏感菌株，但隨著時(shí)間的推移，在早疫病菌群體中正在出現(xiàn)敏感性逐漸下降的個(gè)體，對(duì)該地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)年度間早疫病對(duì)嘧菌酯敏感性監(jiān)測(cè)。

2.3 不同地區(qū)馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性分布

張家口、承德兩地的馬鈴薯早疫病菌株對(duì)嘧菌酯的敏感性程度相近，但不同縣的菌株對(duì)嘧菌酯的敏感性有差異（表2），如承德隆化縣菌株的平均EC50值最低，為0.017 μg/mL，而張家口沽源縣菌株的平均EC50值最高，為0.097 μg/mL。張家口沽源縣和承德豐寧縣與其他地區(qū)相比敏感性下降的菌株更多，且差異顯著。

3 小結(jié)與討論

盡管河北省北部馬鈴薯早疫病菌未出現(xiàn)對(duì)嘧菌酯的抗性菌株，但在早疫病菌群體中已出現(xiàn)對(duì)嘧菌酯敏感性呈逐年下降趨勢(shì)。嘧菌酯對(duì)該地區(qū)早疫病菌群體的毒力EC50為0.01～0.13 μg/mL，與Pasche等[10，11]報(bào)道的早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性基線EC50范圍（0.01～0.07 μg/mL）接近。有87.84%的菌株處于敏感性基線以內(nèi)，而少部分菌株的EC50已超出敏感性基線的上限，其對(duì)嘧菌酯的敏感性已出現(xiàn)下降的趨勢(shì)[11]，說(shuō)明這些菌株已有產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)。

嘧菌酯雖然具有殺菌譜廣、對(duì)環(huán)境和非靶標(biāo)生物安全等優(yōu)點(diǎn)，但藥劑的頻繁使用會(huì)導(dǎo)致病菌迅速產(chǎn)生抗藥性[9]。如黃瓜霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、稻瘟病菌、香蕉黑斑病菌和布氏白粉菌等，都發(fā)現(xiàn)了可穩(wěn)定遺傳的突變型抗性菌株[11，13，14，17-19]。這為我們提前敲響警鐘，要及時(shí)監(jiān)測(cè)馬鈴薯早疫病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性，并合理用藥，預(yù)防菌株在外界巨大用藥壓力下發(fā)生突變而產(chǎn)生抗性。自2013年開(kāi)始，國(guó)內(nèi)已有多個(gè)廠家開(kāi)始生產(chǎn)嘧菌酯藥劑，并在馬鈴薯上進(jìn)行了登記和推廣，因此應(yīng)特別提醒薯農(nóng)避免盲目使用嘧菌酯，應(yīng)與其他殺菌劑進(jìn)行交替使用，以減少早疫病菌對(duì)嘧菌酯抗性的產(chǎn)生。

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