聶倩+張直峰+呂建平+閆桂琴

摘要：試驗(yàn)以吸附率與解析率為考察指標(biāo)，比較4種大孔吸附樹脂D101、D4020、AB-8、X-5對小薊（Cirsium setosum）多糖的純化效果。采用分光光度法測定小薊多糖的含量，用靜態(tài)與動態(tài)吸附-解析方法從4種樹脂中篩選出最適樹脂，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化其純化工藝。結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂為純化小薊多糖的最佳樹脂；其純化最佳工藝條件為：上樣液濃度2.0 mg/mL，上樣量30 mL，流速1.0 mL/min，洗脫劑pH 7.0。在此工藝條件下，AB-8對小薊多糖的解析率可達(dá)77.93%。

關(guān)鍵詞：小薊（Cirsium setosum）；多糖；大孔吸附樹脂；吸附；解析；純化

中圖分類號：Q946.3；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4661-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.041

Isolation and Purification of Polysaccharide from Cirsium setosum

by Macroporous Resin

NIE Qian， ZHANG Zhi-feng， LV Jan-ping， YAN Gui-qin

（School of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041004，Shanxi，China）

Abstract： Using adsorption rate and desorption rate as indexes， the purification effects of four macroporous adsorption resin including D101， D4020， AB-8 and X-5 were compared. Spectrometry method were used to determine the content of polysaccharides isolated from Cirsium setosum by static and dynamic adsorption-analytical method with four resins. After screening the optimal resin， the purification process were optimized with orthogonal test and single factors test. The results showed that AB-8 was the optimum macroporous resin for absorbing polysaccharide from Cirsium setosum. The optimum technology conditions were sample concentration of 2 mg/mL， sample volume of 30 mL， flow velocity of 1.0 mL/min and pH value of eluent of 7.0. The desorption rate of polysaccharides from Cirsium setosum reached 77.93% under the optimal conditions.

Key words：Cirsium setosum； macroporous adsorption resin； polysaccharide； adsorption； desorption；purification

小薊（Cirsium setosum）為菊科植物，具有涼血止血，祛淤消腫的功能，可用于治療衄血、吐血、尿血、便血、崩漏下血、外傷出血、癰腫瘡毒等，是傳統(tǒng)的中藥材，在《本草綱目》、《本草經(jīng)集注》、《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》等中均有記載，其中藥化學(xué)成分有原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、蒙花甙、豆甾醇等。小薊在中國分布廣泛，中歐、東歐、俄羅斯東部、日本、朝鮮等地區(qū)亦有分布，資源極其豐富。小薊同時也可以食用，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是人們喜愛的民間野菜。多糖是存在于植物體內(nèi)的一種天然活性物質(zhì)，因具抗氧化、抗癌、抗病毒、降血糖、抑菌等[1-5]多種活性而被普遍應(yīng)用于保健食品、生物醫(yī)藥、環(huán)保、化妝品等領(lǐng)域[6]。大孔吸附樹脂具有理化穩(wěn)定性高、吸附選擇性強(qiáng)、富集效果好、提取工藝簡便、解析條件溫和、再生簡單、使用周期長、分離效率高、分離得到的有效成分純度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于天然植物中活性成分的提取、分離和純化[7]。大孔吸附樹脂對于多糖提取是比較理想的吸附劑[8-10]。但是目前國內(nèi)鮮見采用大孔吸附樹脂分離、純化小薊多糖的研究報道?；诖?，本研究對純化小薊多糖大孔樹脂進(jìn)行了篩選并對其純化工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以期為小薊資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 試驗(yàn)用小薊：采自臨汾市古縣，洗凈于55 ℃烘干，粉碎后過60～80目篩備用。試劑：石油醚、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙醚（均為分析純）、葡萄糖、蒽酮、濃硫酸。大孔吸附樹脂：分別為AB-8、D4020、X-5、D101，購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所（均為一級品）。

1.1.2 儀器 D101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），高速萬能粉碎機(jī)（天津市斯泰儀器有限公司），BS-110S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），H-1850R型離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），HHS-6型電熱恒溫水浴鍋（海寧市新華醫(yī)療器械廠），RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），754型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 粗多糖的制備 稱取小薊粉末60 g，按料液比（g/mL，下同）1∶10加入600 mL蒸餾水，于60 ℃超聲提取30 min，提取液經(jīng)過濾收集，濾渣加入450 mL蒸餾水按上述步驟再次提取1次，合并濾液并濃縮至100 mL，依次經(jīng)石油醚脫脂，氯仿-正丁醇（體積比為5∶1）脫蛋白4次[11]后加入3倍體積的95%乙醇，于4 ℃醇沉過夜，離心，沉淀依次用適量無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，將沉淀真空干燥至恒重，得粗多糖備用。

1.2.2 小薊多糖含量的測定 采用蒽酮—濃硫酸法[12]對小薊多糖含量進(jìn)行測定。以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品在625 nm處測定吸光度，以葡萄糖溶液的濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=2.85x+0.002 8，R2=0.997 3。

精密稱取干燥后粗多糖20 mg，溶于20 mL蒸餾水中，得1 mg/mL的樣液。按上述方法測定其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算其多糖含量。

1.2.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 將大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡24 h，充分膨脹后，用乙醇洗至洗脫液加3倍量蒸餾水無白色混濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗至無醇味，浸泡于蒸餾水中備用。

1.2.4 大孔樹脂的篩選

1）靜態(tài)吸附[13]與靜態(tài)解析試驗(yàn)。精密稱取經(jīng)預(yù)處理的4種大孔吸附樹脂各3份，每份2 g，置于250 mL錐形瓶中，并分別加入150 mL一定濃度的多糖樣品溶液，置于搖床，室溫下振蕩吸附360 min，每隔30 min取一次樣，測定其多糖含量，根據(jù)公式（1）、（2）計(jì)算大孔樹脂的吸附量及吸附率。

Q=（C0-Ce）×V1/m （1）

E=（C0-Ce）/C0×100%（2）

公式（1）、（2）中，Q為吸附量（mg/g）；C0為吸附前樣品溶液多糖含量（mg/mL）；Ce為吸附后溶液多糖含量（mg/mL）；V1為提取液體積（mL）；m為樹脂干重（g）；E為吸附率。

將靜態(tài)吸附試驗(yàn)過濾后的大孔吸附樹脂置于250 mL的錐形瓶中，加入150 mL蒸餾水作為洗脫劑，置于搖床振蕩解吸240 min，每隔30 min取一次樣，測定其多糖含量，根據(jù)公式（3）、（4）計(jì)算大孔樹脂的解析量及解析率。

D=C′×V2/m（3）

E′=C′×V2/（C0-Ce）×V1×100%（4）

公式（3）、（4）中，D為解析量（mg/g）；C′為洗脫液中樣品溶液多糖的含量（mg/mL）；V2為洗脫液體積（mL）；E′為解析率。

2）動態(tài)吸附與動態(tài)解析試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取一定量經(jīng)過預(yù)處理的4種大孔樹脂，濕法裝柱（1.2 cm×30 cm，層析柱徑高比為1∶25，體積為33.912 cm3），吸取一定濃度（與靜態(tài)吸附試驗(yàn)中的多糖樣品溶液濃度相同）的多糖樣液30 mL，控制流速為1.0 mL/min，待吸附完成后，測定其多糖含量，按照公式（1）、（2）計(jì)算樹脂的吸附量及吸附率。以pH 7.0的蒸餾水作為洗脫劑，采用與吸附試驗(yàn)相同的流速進(jìn)行洗脫，待解析完成后，測定其多糖含量，按照公式（3）、（4）計(jì)算樹脂的解析量及解析率。

1.2.5 大孔樹脂動態(tài)吸附單因素的確定 按“1.2.4”中動態(tài)吸附試驗(yàn)的方法濕法裝柱。再分別考察上樣液濃度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL）、上樣量（10、20、30、40、50、60 mL）、流速（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min）和洗脫劑pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）對大孔樹脂動態(tài)吸附與解析效果的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化大孔樹脂純化小薊多糖工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以小薊多糖解析率為考察指標(biāo)，分別選取上樣液濃度、上樣量、流速和洗脫劑pH 4個因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定大孔樹脂純化小薊多糖的最佳工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

2.1.1 靜態(tài)吸附與靜態(tài)解析試驗(yàn)結(jié)果 由于物化性質(zhì)的不同，各種型號樹脂對多糖的吸附及解析能力是不同的。由圖1可知，4種大孔樹脂對小薊多糖的吸附量均隨吸附時間的增加呈相似的上升趨勢，且均在270 min時趨于飽和，至360 min時均達(dá)飽和平衡狀態(tài)。4種大孔樹脂對小薊多糖的最終吸附量排序?yàn)椋篨-5>AB-8>D101>D4020。

在篩選最佳樹脂的過程中，需要綜合考慮樹脂的吸附能力，不僅需要吸附能力強(qiáng)，還需要有較強(qiáng)的解析能力才能保證有效成分被最大限度回收[14]。由圖2可知，大孔樹脂靜態(tài)解析曲線趨勢與靜態(tài)吸附曲線的趨勢類似，其對小薊多糖的解析量均在210 min時趨于飽和，240 min時達(dá)平衡飽和狀態(tài)。綜合分析后認(rèn)為AB-8樹脂的解析能力整體較高。4種大孔樹脂對小薊多糖的最終解析量排序?yàn)椋篈B-8>X-5>D101>D4020。

綜合靜態(tài)吸附與靜態(tài)解析試驗(yàn)結(jié)果如表2。由表2可見，雖然X-5樹脂的吸附率最高，但其解析率最低，僅為60.92%；D4020樹脂的解析率是最高的，但其吸附率卻是最低的，僅為42.78%。綜合考慮剩余的D101和AB-8樹脂，認(rèn)為AB-8樹脂對小薊多糖的靜態(tài)吸附及解析能力均較強(qiáng)。

2.1.2 動態(tài)吸附與動態(tài)解析試驗(yàn)結(jié)果 動態(tài)吸附及動態(tài)解析試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，4種樹脂對小薊多糖均有較好的動態(tài)吸附及解析性能。綜合分析其動態(tài)吸附及解析結(jié)果，得出其動態(tài)吸附及解析能力排序?yàn)椋篈B-8>D101>D4020>X-5。

比較靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附的結(jié)果，綜合分析后認(rèn)為AB-8樹脂是分離純化小薊多糖的最佳樹脂，且其動態(tài)吸附效果優(yōu)于靜態(tài)吸附效果。

2.2 大孔樹脂動態(tài)吸附單因素的確定

2.2.1 上樣液濃度對大孔樹脂動態(tài)吸附與解析能力的影響 將小薊多糖的初始濃度分別配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL，上樣量為30 mL，以1.0 mL/min的流速過柱吸附，待充分吸附后，用pH為7.0的洗脫劑進(jìn)行解析，其結(jié)果見圖3。由圖3可見，小薊多糖解析率在上樣液濃度為2.0 mg/mL時達(dá)到最高峰，之后其解析率隨上樣液濃度的增加而降低。這是因?yàn)樯蠘右簼舛鹊蜁r，樹脂未被飽和；上樣液濃度過大時，小薊多糖向樹脂內(nèi)部擴(kuò)散的速度減慢，堵塞樹脂孔隙從而影響其吸附和解析[15]。因此，上樣液濃度以2.0 mg/mL為宜，此時，小薊多糖解析率為77.69%。

2.2.2 上樣量對大孔樹脂動態(tài)吸附與解析能力的影響 分別加入10、20、30、40、50、60 mL樣液過柱，其他條件同“2.2.1”，進(jìn)行動態(tài)吸附與解析，其結(jié)果見圖4。由圖4可見，上樣量為30 mL時，小薊多糖解析率最高，為72.08%；之后隨上樣量的增加小薊多糖解析率逐漸減少。因此，上樣量以30 mL為宜。

2.2.3 流速對大孔樹脂動態(tài)吸附與解析能力的影響設(shè)定大孔樹脂動態(tài)吸附與解析的流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，其他條件同“2.2.1”，進(jìn)行動態(tài)吸附與解析，其結(jié)果見圖5。由圖5可見，流速在0.5～1.5 mL/min時，小薊多糖的解析率隨流速的提高而略有降低。但當(dāng)流速高于1.5 mL/min時，小薊多糖的解析率下降較多。雖然流速在0.5 mL/min時小薊多糖的解析率最高，但流速太低，多糖流出速度慢，耗時長；而流速過快時，樹脂的交換量降低，從而降低了純化效率，不能完全發(fā)揮出樹脂的吸附能力。因此綜合分析后認(rèn)為以1.5 mL/min的流速進(jìn)行動態(tài)吸附與解析為宜。

2.2.4 洗脫劑pH對大孔樹脂動態(tài)吸附與解析能力的影響 將洗脫劑pH分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其他條件同“2.2.1”，進(jìn)行動態(tài)吸附與解析，其結(jié)果見圖6。由圖6可見，洗脫劑的pH對大孔樹脂的解析性能有一定的影響。洗脫劑pH從5.0上升到7.0時，小薊多糖的解析率呈增加趨勢，且在pH7.0時達(dá)到最高，為70.72%；但洗脫劑pH從7.0上升到10.0時，小薊多糖的解析率呈下降趨勢。因此，洗脫劑pH選擇7.0為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可見，各因素對小薊多糖解析率的影響排序?yàn)锳>B>D>C，即上樣液濃度對小薊多糖解析率的影響最為明顯，其次為上樣量，洗脫劑pH和流速的影響較小。其最佳工藝組合為A2B2C1D1，即上樣液濃度為2.0 mg/mL，上樣量為30 mL，流速為1.0 mL/min，洗脫劑pH為7.0。

以正交試驗(yàn)所得最佳工藝條件進(jìn)行3次動態(tài)吸附驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果小薊多糖的解析率分別為77.97%、78.13%、77.69%，平均為77.93%。表明該純化方法穩(wěn)定可靠且重現(xiàn)性好。

3 小結(jié)與討論

小薊作為2005年《中國藥典》版收載的常用中藥，具有許多醫(yī)用功效。但對于小薊的研究多集中于對其化學(xué)成分的研究，對其有效成分純化的研究較少。楊星昊等[16]進(jìn)行了大孔樹脂純化小薊總黃酮的研究，表明AB-8和HP-20較適合于分離純化小薊總黃酮。但對小薊多糖成分的提取純化的優(yōu)化鮮見報道。張海暉等[17]對板栗殼中原花青素大孔吸附樹脂分離純化工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明AB-8樹脂的效果最佳；付克等[18]運(yùn)用大孔樹脂對柴芩清肝方提取物進(jìn)行純化，結(jié)果表明AB-8為最佳樹脂；季志紅等[19]運(yùn)用大孔樹脂對毛頭牛蒡子多糖進(jìn)行了分離純化的工藝研究，結(jié)果表明AB-8的純化效果最佳；宋歌等[20]優(yōu)選大孔吸附樹脂分離純化蜘蛛香中環(huán)烯醚萜類成分，結(jié)果表明AB-8有良好的吸附性能；孫明禮[21]對半枝蓮多糖的脫色劑進(jìn)行篩選并對其優(yōu)化，結(jié)果表明AB-8有較優(yōu)效果，解析率高達(dá)83.22%；仰榴青等[22]對大孔吸附樹脂純化銀杏外種皮多糖進(jìn)行了研究，認(rèn)為AB-8吸附性能最好。以上研究結(jié)果均顯示出AB-8有較優(yōu)的吸附和解析效果，這與本試驗(yàn)所得結(jié)果一致。

影響大孔吸附樹脂分離純化的因素較多，為了達(dá)到較好的分離純化效果，本試驗(yàn)對大孔樹脂的型號進(jìn)行了篩選，對大孔樹脂的吸附和解析的影響因素進(jìn)行了考察。在4種不同型號的大孔吸附樹脂中AB-8具有較強(qiáng)的吸附和解析能力，為純化小薊多糖的最佳樹脂。正交試驗(yàn)結(jié)果表明4因素對小薊多糖解析率影響的排序?yàn)锳>B>D>C；其純化最佳工藝條件為：上樣液濃度2.0 mg/mL，上樣量30 mL，流速1.0 mL/min，洗脫劑pH 7.0。在此條件下，AB-8對小薊多糖的解析率可達(dá)77.93%。通過該工藝，可以有效去除多糖中脂溶性雜質(zhì)等，選擇性地保留有效成分，提高了小薊多糖的純度。且正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可靠、科學(xué)合理且重現(xiàn)性好。為小薊多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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