姜紅堃,郭燕平,李雷,姜紅,白英龍
(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科,沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科,沈陽 110003;3.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生學(xué)教研室,沈陽 110001)
常染色體顯性遺傳性多囊腎(autosomal domi?nant polycystic kidney disease,ADPKD)是一種常見的遺傳性腎病,發(fā)生率為活產(chǎn)新生兒的0.1%~0.25%,是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要病因之一[1]。其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,涉及多種基因表達(dá)及蛋白質(zhì)功能異常,迄今尚未明確。腎小管分化增生異常是腎囊性病變的主要原因之一[1~3]。人類TBX1基因(Gene ID:6899)定位于22q11.21,為染色體22q11.2微缺失中重要基因[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),胚胎腎發(fā)育過程中TBX1在腎小管中高表達(dá),發(fā)育成熟后表達(dá)微弱;而急性腎小管損傷時(shí)表達(dá)再次升高,提示該基因可能與腎小管發(fā)育及損傷修復(fù)密切相關(guān)[5]。本研究擬通過檢測(cè)ADPKD患者多囊腎組織TBX1 mRNA及蛋白表達(dá),探討TBX1基因在ADPKD發(fā)病中的潛在機(jī)制,為產(chǎn)前診斷及遺傳干預(yù)提供理論依據(jù)。
多囊腎組織標(biāo)本11例,來自本院2009年至2013年明確診斷為ADPKD患者并經(jīng)手術(shù)切除的多囊腎組織,男7例,女 4例,年齡(43±5.3)歲。對(duì)照組腎組織標(biāo)本7例,來自本院2010年至2013年外科切除的正常腎組織,男4例,女3例,年齡(46±3.5)歲。所留取腎組織部分置于經(jīng)焦炭酸二乙酯(pyro carbonic acid diethyl ester,DEPC)處理過的EP管中,馬上轉(zhuǎn)移至-80冰箱保存待檢;部分置于多聚甲醛溶液(4 g/L)中固定、包埋。本研究的標(biāo)本使用均經(jīng)受試對(duì)象知情并簽字同意,經(jīng)本院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)討論通過。
1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成:TBX1:上游5′&x100ccf;ACGACAACGGCCACATTATTC &x100ccf; 3′,下游5′&x100ccf; CCTCGGCATATTTCTCGCTATCT&x100ccf;3′,產(chǎn)物長度102 bp。內(nèi)參β&x100ccf;actin:上游5′&x100ccf; GCCCTGGATTTTGAGAATGA &x100ccf;3′,下游5′&x100ccf; ATGCCAGCAGATTCCATACC &x100ccf;3′,產(chǎn)物長度155 bp。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。
1.2.2 總RNA提取及cDNA合成:利用Trizol RNA抽提試劑盒提取RNA(美國Invitrogen公司),經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度(A260/280)比值,獲得RNA濃度和純度,并經(jīng)電泳檢測(cè)RNA分子完整性。高速低溫離心機(jī)由美國Beckman公司提供;用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物有限責(zé)任公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈,反應(yīng)總體積為20 L,反應(yīng)條件為:4260 min,995 min,45 min。cDNA置于-20冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 qPCR反應(yīng):采用SYBR Green PCR Master mix(美國Applied Biosystems公司)染料法進(jìn)行TBX1基因qPCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系如下:cDNA 1.0 L,2×SYBR Green PCR Master mix 25 L,引物(上下游引物的終濃度各為900 nmol/L)2.0 L,ddH2O 22.0 L。反應(yīng)條件:50°C 2 min → 95°C 10 min →(92°C 15 s→ 56.5°C 1 min)×40個(gè)循環(huán)。以β&x100ccf;actin為內(nèi)參,校正每個(gè)樣本的Ct,采用thermal cycler軟件包計(jì)算Ct值,以2-計(jì)算基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。熒光定量實(shí)時(shí)PCR儀(7500型)由美國Applied Biosystems公司提供。
1.3.1 腎組織總蛋白的提?。喝±鋬鰝溆玫哪I組織100 mg,加入1 mL蛋白裂解液,于冰上超聲波粉碎機(jī)下將組織粉碎,電動(dòng)勻漿,離心后取上清;按照蛋白抽提試劑盒(美國Active Motif公司)使用說明進(jìn)行蛋白抽提,應(yīng)用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
1.3.2 電泳及轉(zhuǎn)膜:將40 μg蛋白抽提物加樣于十二烷基硫酸鈉&x100ccf;聚丙烯酰胺凝膠中電泳4 h,后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美國Amersham公司)。
1.3.3 雜交及顯色:取下PVDF膜,脫脂奶(50 g/L)封閉膜1 h,加入山羊源性TBX1或β&x100ccf;actin抗體(1∶1 000稀釋,美國Santa Cruz公司),室溫孵育1 h。TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體(1∶1 000稀釋,美國Santa Cruz公司),室溫孵育1 h。TBST洗滌后加入ECL顯色試劑(美國Amersham公司),曝光于Kodak膠片。應(yīng)用凝膠圖像掃描儀(美國gene公司)進(jìn)行定量分析。
將新鮮腎組織放入多聚甲醛溶液(4 g/L)中固定24 h,常規(guī)方法脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,加入山羊源性TBX1抗體(1∶200稀釋,美國Santa Cruz公司),37孵育1~2 h,加入兔抗羊IgG抗體(1∶200稀釋,美國Santa Cruz公司),37濕盒中孵育30 min,用DAB顯色液進(jìn)行顯色,脫水、透明、封片,光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)染色結(jié)果,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。
qRT&x100ccf;PCR結(jié)果表明ADPKD多囊腎腎組織TBX1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.582,P=0.000,表1)。
Western blot結(jié)果表明ADPKD多囊腎腎組織TBX1蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.625,P=0.000,表1,圖1)。
免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明TBX1在對(duì)照組腎組織的腎小管上皮細(xì)胞中呈微量表達(dá);而在多囊腎囊腫組織上皮細(xì)胞中呈較強(qiáng)陽性表達(dá),腎囊腫組織中可見腎小管囊性擴(kuò)張,腎間質(zhì)纖維化(圖2)。
圖1 Westernblot檢測(cè)多囊腎組與對(duì)照組腎組織TBX1蛋白表達(dá)Fig.1 TBX1 protein expression was assayed by Western blot
多囊腎病是最常見的遺傳性腎臟疾病之一,分為常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳,其中ADPKD較多見。ADPKD生后即已存在,但多于40~50歲才出現(xiàn)癥狀,故又稱成人型多囊腎[6]。ADPKD臨床表現(xiàn)為腰痛、高血壓、尿路感染、血尿及腎結(jié)石,最終發(fā)展為腎功能衰竭,約占終末期腎衰病因的5%~10%。此外常合并肝、胰、脾、松果體、精囊、肺等腎外的多器官囊腫,ADPKD腎臟有多個(gè)囊腫形成并進(jìn)行性增大[7]。本實(shí)驗(yàn)在ADPKD患者腎囊腫組織中可見腎小管囊性擴(kuò)張,腎間質(zhì)纖維化,囊間腎單位萎縮,為典型多囊腎病理表現(xiàn)。
表1 多囊腎組與對(duì)照組腎組織TBX1 mR NA及蛋白表達(dá)水平比較(±s)Tab.1 Expression of TBX1 mRNA or protein level in kidney tissues of the two groups(±s)
表1 多囊腎組與對(duì)照組腎組織TBX1 mR NA及蛋白表達(dá)水平比較(±s)Tab.1 Expression of TBX1 mRNA or protein level in kidney tissues of the two groups(±s)
Group n Age(years) TBX1 mRNA TBX1 protein Control 7 46±3.5 1.00±0.02 1.00±0.06 ADPKD 11 43±5.3 12.36±1.15 17.18±2.53
圖2 免疫組化檢測(cè)多囊腎組與對(duì)照組腎組織TBX1蛋白表達(dá) bar=20μmFig.2 TBX1 protein expression was assayed by Immunohistochemistry bar=20μ
ADPKD腎組織囊腫發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制基本相同,主要包括:腎小管上皮細(xì)胞過度增生及異常分化;細(xì)胞因子、生長因子及趨化因子等物質(zhì)的增多,導(dǎo)致非感染性腎間質(zhì)纖維化;細(xì)胞外基質(zhì)低分子量糖蛋白、纖維蛋白及型膠原蛋白增多,導(dǎo)致基膜順應(yīng)性改變,囊腫內(nèi)液體異常積聚,腎小管囊腫形成并進(jìn)行性增大[2]。研究表明,的異常分泌及其受體高表達(dá)可以促進(jìn)ADPKD腎組織囊的產(chǎn)生及其相關(guān)信號(hào)分子可能成為ADPKD的生物標(biāo)識(shí)物及治療靶標(biāo)[8]。體外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,RAGE基因功能被阻滯后可降低ADPKD模型鼠多囊腎組織囊的發(fā)生及擴(kuò)大,病變腎臟體積及重量明顯降低,尿素氮及肌酐水平逐漸降低[9]。Wnt7a、Wnt7b及基因過表達(dá)可導(dǎo)致腎囊性病變的發(fā)生及增殖[10,11]。囊性腎病模型小鼠胚胎腎組織96表達(dá)明顯異常[12]。
人類TBX1基因是T&x100ccf;box轉(zhuǎn)錄因子家族成員,后者在種系發(fā)生及進(jìn)化過程中趨于保守,成員均包含一個(gè)相同的DNA結(jié)合域,即T&x100ccf;box。TBX1基因是已知在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子,為調(diào)控咽弓、動(dòng)脈弓、心臟流出道及間隔正常形成的關(guān)鍵基因,參與心臟、耳、甲狀腺、胸腺、牙齒等多種組織和器官的發(fā)育過程,在精神疾病發(fā)病中亦扮演一定角色[13~19]。目前國內(nèi)外圍繞TBX1基因的研究多集中于其與心臟畸形的關(guān)系,而對(duì)于該基因與腎臟發(fā)育與疾病的研究較少。研究證實(shí)缺乏Shh基因的小鼠中,TBX1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)[20];而Shh基因缺失可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因鼠后腎間充質(zhì)發(fā)育異常,將脊索及底板的Shh基因滅活后可導(dǎo)致腎臟融合出現(xiàn)蹄形腎[21]。另有研究表明,TBX1基因在胚鼠腎臟發(fā)育中呈波動(dòng)表達(dá),其蛋白與HOXD10相互作用參與腎臟發(fā)育[22]。
課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎小管損傷模型鼠中,腎小管上皮細(xì)胞TBX1基因表達(dá)明顯增強(qiáng),提示該基因可能參與腎小管上皮的損傷修復(fù)過程[5]。本研究實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,ADPKD多囊腎腎組織TBX1 mRNA及蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著增強(qiáng)。此外免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示,TBX1蛋白在對(duì)照組腎組織腎小管上皮細(xì)胞中呈微量陽性表達(dá),而在多囊腎囊腫組織上皮細(xì)胞中呈較強(qiáng)陽性表達(dá),與囊腫發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制相契合。由此推測(cè)TBX1基因可能參與腎小管上皮細(xì)胞的增殖與分化,其過量表達(dá)可能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞過度增殖,從而導(dǎo)致囊腫的發(fā)生及增大。TBX1基因表達(dá)異??赡苁瞧鋮⑴c腎臟囊性病變發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制之一。
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