金烏健骨方對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清炎癥因子的影響

龍小琴 陸道敏 馬武開(kāi) (貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院研究生院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

苗藥金烏健骨方由金毛狗脊、烏梢蛇、千年健、黑骨藤、青風(fēng)藤、姜黃、白芍、三七粉等藥物組成，具有溫腎助陽(yáng)、散寒通絡(luò)、活血止痛之功效。前期的臨床研究顯示苗藥金烏健骨方能夠改善類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者的臨床癥狀和體征〔1〕，尤其在降低抗風(fēng)濕藥如甲氨蝶呤等的毒副作用方面顯示了較好療效〔2〕。本實(shí)驗(yàn)觀察金烏健骨方對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠血清炎癥因子白介素-1(IL-1)、白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)的影響，研究金烏健骨方治療RA的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 成年健康雌性Wistar大鼠60只，體重(173±20)g，由重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào):SCXK(渝)2009001。各組大鼠在相同條件下自由飲食、攝水。飼料來(lái)源于貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑、儀器 牛二型膠原、完全弗氏佐劑(美國(guó) Sigma公司);醋酸(無(wú)錫飛鵬精細(xì)化工有限公司);IL-1、IL-1β及TNF-α酶免免試劑盒(北京惠康生物科技有限公司);低溫冷凍離心機(jī)(德國(guó)eppendorf);冰箱(日本三洋);酶標(biāo)儀(BioTek品牌，型號(hào):Synergy 2 TM);電子秤(上海酬勤實(shí)業(yè)有限公司);大鼠足趾容積測(cè)量?jī)x(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 ①金烏健骨方:金毛狗脊15 g，烏梢蛇10 g，千年健 15 g，黑骨藤9 g，青風(fēng)藤30 g，姜黃20 g，白芍30 g，三七粉3 g(生藥購(gòu)自貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)等8味中藥組成。金烏健骨方濃縮液按處方比例提取，濃縮至1.5 g/ml，4℃冰箱保存供實(shí)驗(yàn)用。②雷公藤多苷:湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，臨用時(shí)充分研磨后用蒸餾水配成混懸液，濃度為 1.2 mg/ml。

1.4 動(dòng)物分組 60只SD雌性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白組，模型組，雷公藤多苷組及金烏健骨方低、中、高劑量組共6組，每組10只。

1.5 造模 實(shí)驗(yàn)前1 d用牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L醋酸中，4℃冰箱過(guò)夜，按2 mg/ml比例與弗氏不完全佐劑1∶1充分混合乳化。取適量牛Ⅱ型膠原溶液(濃度2 mg/ml)逐滴加入至等容積的不完全弗氏佐劑中，終濃度為1 mg/ml。冰浴中充分乳化，以滴入水中不擴(kuò)散為度，取乳化后的混合物按0.3 ml注射。7 d后按 0.2 ml/只，于尾根部皮下加強(qiáng)免疫 1次〔3〕。

1.6 給藥 從第2次免疫后第1天開(kāi)始給藥，空白組和模型組大鼠給予蒸餾水灌胃，2 ml/次，1次/d;雷公藤多苷組給予雷公藤多苷水溶液，劑量為6 mg/kg，2 ml/次，1次/d;金烏健骨方低、中、高劑量組分別給予不同質(zhì)量濃度的金烏健骨方濃縮液(3 570、7 500、15 000 mg/kg)，2 ml/次，1 次/d，各組均連續(xù)灌胃28 d。

1.7 觀察指標(biāo) ①一般行為表現(xiàn):動(dòng)物神態(tài)、毛色、活動(dòng)情況、飲食及飲水量、大小便。②體重:分別于造模前1 d用電子天平稱(chēng)量各組動(dòng)物體重以后每周稱(chēng)量1次。③關(guān)節(jié)腫脹程度:分別于造模前1 d用大鼠足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量各組大鼠左后足踝關(guān)節(jié)容積。腫脹率=造模后足踝關(guān)節(jié)容積-造模前足踝關(guān)節(jié)容積/造模前足踝關(guān)節(jié)容積×100%。末次灌胃24 h以后，予烏拉坦按大鼠體重以0.4 ml/100 g予腹腔內(nèi)注射麻醉，股動(dòng)脈抽血4～6 ml，室溫靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，用吸液管取血清，置于凍存管-20℃冰箱待測(cè)。④放射酶聯(lián)免疫學(xué)方法(ELISA)測(cè)定血清 IL-1β、IL-1、TNF-α 水平(嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作)⑤取CIA大鼠右膝關(guān)節(jié)滑膜及部分軟骨放于4%甲醛固定，8%EDTA溶液脫鈣，常規(guī)梯度脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色。光鏡下觀察普通病理變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用s表示，符合正態(tài)分布和方差齊性組間比較應(yīng)用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的組間比較應(yīng)用多個(gè)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況變化 空白組大鼠隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體重增加、活動(dòng)自如、皮毛光澤、精神狀態(tài)良好，無(wú)異常狀態(tài)出現(xiàn)。模型組大鼠毛發(fā)干枯無(wú)光澤、飲食量及飲水量減少、精神萎靡，后期可見(jiàn)行走困難及關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙等。雷公藤多苷組及金烏健骨方各劑量組大鼠的飲食情況、精神狀態(tài)及關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙均較模型組好。

2.2 體重變化及左后足踝關(guān)節(jié)容積比較 造模前，各組大鼠體重關(guān)節(jié)大小無(wú)差異(P＞0.05)，灌胃2 w后體重比較，與空白組大鼠比較，模型組、雷公藤多苷組及金烏健骨方低、中、高劑量組大鼠體重增長(zhǎng)減慢，灌胃4 w后模型組體重增長(zhǎng)明顯低于空白組(P＜0.05)，見(jiàn)表1。關(guān)節(jié)腫脹于造模后4～5 d出現(xiàn)，模型組大鼠于第3周關(guān)節(jié)腫脹達(dá)到高峰，治療組大鼠均于第2周左右達(dá)到高峰，以后逐漸降低，其降低速度明顯快于模型組大鼠(P＜0.05)，金烏健骨方各劑量組比較，低、中劑量間無(wú)顯著性差異，而與高劑量間有極顯著性差異，表明用金烏健骨方3個(gè)劑量治療后，中、高劑量呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的足腫脹。見(jiàn)表2。

2.3 各組血清 IL-1β、IL-1、TNF-α水平 模型組大鼠血清中IL-1、IL-1β、TNF-α 值與空白組相比升高(P＜0.01)，說(shuō)明造模成功;經(jīng)金烏健骨方3個(gè)劑量及雷公藤治療后，IL-1β、IL-1、TNF-α水平均較模型組顯著減低(P＜0.05)。其中TNF-α在金烏健骨方低、中、高3個(gè)劑量中表達(dá)呈減少趨勢(shì)，表明金烏健骨方對(duì)CIA的TNF-α免疫抑制作用隨劑量增加而加強(qiáng)，并且在短時(shí)間內(nèi)持續(xù)抑制。金烏健骨方對(duì)CIA大鼠的IL-1、IL-1β表達(dá)水平的影響與劑量關(guān)系無(wú)明顯的規(guī)律性。見(jiàn)表3。

2.4 金烏健骨方對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨病理的影響

空白組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織光滑完整，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、血管增生及纖維素滲出。模型組滑膜組織可見(jiàn)明顯的血管增生、增厚、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫，軟骨組織增生;隨著關(guān)節(jié)癥狀的加重，滑膜組織新生血管逐漸增多、血管擴(kuò)張、充血，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。金烏健骨方高劑量組與雷公藤多苷組滑膜組織可見(jiàn)少量新生，未見(jiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)改變。金烏健骨方中劑量組可見(jiàn)少量新生血管及滑膜增生，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫，軟骨輕度增生，少數(shù)關(guān)節(jié)軟骨破壞。金烏健骨方低劑量組可見(jiàn)明顯新生血管及滑膜增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫，軟骨輕度增生及關(guān)節(jié)軟骨破壞程度較金烏健骨方中劑量組重。見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠體重變化(s，n=10)

表1 各組大鼠體重變化(s，n=10)

與空白組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01，下表同

組別 造模前1 d 灌胃2 w后 灌胃4 w后空白組 180.6±16.7 247.2±17.5 307.9±38.7模型組 178.9±14.4 209.9±19.41) 235.9±23.42)雷公藤多苷組 164.8±18.8 237.2±28.83) 274.3±18.93)金烏健骨方低劑量組 170.1±24.0 225.3±24.0 263.9±21.71)金烏健骨方中劑量組 168.8±18.2 221.8±22.2 285.1±19.33)金烏健骨方高劑量組 179±16.33) 241±11.23) 301.2±25.64)

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理(HE，×10)

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)容積變化(s，n=10)

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)容積變化(s，n=10)

組別 造模前1 d 灌胃2 w后 灌胃4 w后空白組 0.24 1.6 4.16 2.0 8.31 1.7模型組 0.27±1.9 35.0±5.92) 47.5±5.22)雷公藤多苷組 0.26±1.3 24.2±7.33) 11.7±4.64)金烏健骨方低劑量組 0.25±1.2 28.7±6.71) 25.1±2.32)3)金烏健骨方中劑量組 0.26±1.0 23.7±7.31)3) 17.3±3.71)3)金烏健骨方高劑量組 0.25±1.3 23.6±8.01)3) 10.2±1.74)

表3 各組IL-1β、IL-1、TNF-α水平比較(s，n=10)

表3 各組IL-1β、IL-1、TNF-α水平比較(s，n=10)

空白組 29.40±4.41 81.31±6.34 176.40±40.41模型組 69.15±5.852)138.37±4.541)380.15±83.852)雷公藤多苷組 36.59±3.273) 84.24±5.563)262.96±55.101)3)金烏健骨方低劑量組 32.97±4.21 99.38±6.323)334.02±38.182)金烏健骨方中劑量組 31.12±3.343) 87.33±7.783) 254±58.291)4)金烏健骨方高劑量組 32.17±2.384) 85.24±4.053) 189±38.104)

3 討論

RA是以對(duì)稱(chēng)性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、進(jìn)行性、侵襲性疾病，進(jìn)行性的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞時(shí)其病理學(xué)的主要特點(diǎn)，病理變化主要為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，初期滑膜充血、水腫、增厚，血管翳形成，軟骨和軟骨下骨破壞。屬中醫(yī)“痹證”、“歷節(jié)”、“尪痹”范疇，本病的發(fā)生多以肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)、寒濕或濕熱入絡(luò)為主要病機(jī)，治療應(yīng)以祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨為主。金烏健骨湯中金毛狗脊、烏梢蛇有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰脊、祛風(fēng)濕、通經(jīng)活血之效，千年健、小花青風(fēng)藤、黑骨藤祛風(fēng)止痛、強(qiáng)筋健骨，三七、姜黃活血止痛;白芍養(yǎng)血，緩急止痛，全方具有溫腎助陽(yáng)、散寒通絡(luò)、活血止痛之功效。從補(bǔ)腎、強(qiáng)筋、健骨、活血、養(yǎng)血、祛風(fēng)、通絡(luò)、定痛等多角度組方，形散而力專(zhuān)，配合精當(dāng)。

本實(shí)驗(yàn)觀察證明CIA大鼠具有與RA相似的慢性、反復(fù)發(fā)病的特點(diǎn)。本文結(jié)果說(shuō)明金烏健骨方能控制CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹，對(duì)大鼠CIA有明顯的治療作用。關(guān)節(jié)滑膜是RA發(fā)病的靶器官，成纖維樣滑膜細(xì)胞是滑膜組織的重要組成部分，其分泌高水平促炎性細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子、基質(zhì)蛋白降解酶等，持續(xù)刺激滑膜細(xì)胞，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞的增殖與凋亡失衡，可誘發(fā)滑膜細(xì)胞增殖的刺激因素主要包括IL-1β，IL-1，TNF-α等。其中IL-1是一種重要的炎性細(xì)胞因子，它參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，炎癥等許多的過(guò)程，在慢性炎癥中IL-1的調(diào)節(jié)障礙、延遲合成以及釋放都會(huì)導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生。IL-1包括IL-1a和IL-1β，IL-1、IL-1β能作用于內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集，引起RA關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)發(fā)生。TNF-α是RA發(fā)病機(jī)制中處于重要地位的促炎性細(xì)胞因子，參與了RA多種致病機(jī)制，包括內(nèi)皮細(xì)胞的激活、細(xì)胞因子的誘導(dǎo)、白細(xì)胞的聚集、破骨細(xì)胞的活化與軟骨的破壞等〔4〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金烏健骨方治療組顯著抑制了IL-1β、IL-1、TNF-α的表達(dá)，對(duì)CIA大鼠有顯著的治療作用。

1 馬武開(kāi)，鐘 琴，姚血明.苗藥金烏健骨湯治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床觀察〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2010;25(12):2190-2.

2 馬武開(kāi)，鐘 琴，姚血明，等.苗藥金烏健骨湯對(duì)MTX治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎耐藥患者增效作用研究〔J〕.中醫(yī)雜志，2010;51(5):61.

3 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:920.

4 陳如平，王昌興，王偉東，等.類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中腫瘤壞死因子-α的表達(dá)及意義〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2011;17(5):647-9.