顏麗萍 管小倩 田小林 石曉萍 李 弘

大腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一，我國大腸癌的發(fā)病率和病死率位居惡性腫瘤的第4位，且呈逐年上升趨勢[1]。目前，外科手術(shù)治療仍然是大腸癌的最主要治療方法。但是仍有一部分患者在接受了根治性手術(shù)后，出現(xiàn)了局部復發(fā)和轉(zhuǎn)移。根治術(shù)后患者5年生存率在50%左右，總體療效并未明顯改善。間質(zhì)化療可以將抗癌藥物制備成緩釋劑型局部植入，從而達到局部持久化療，降低大腸癌的復發(fā)及轉(zhuǎn)移，還可避免全身不良反應[2-3]。本研究旨在通過檢測氟尿嘧啶植入劑對大腸癌患者外周血survivin、caspase-3、CD44V6的影響，探討其抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年3月—2013年4月桂林市第二人民醫(yī)院和桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外科收治的結(jié)直腸癌患者64例，男37例，女27例。納入標準：術(shù)前未行化療、未使用免疫抑制劑，無手術(shù)禁忌證可按常規(guī)行根治性手術(shù)。將64例患者按隨機數(shù)字表法分為治療組和對照組，每組32例。治療組在手術(shù)結(jié)束前根據(jù)腫瘤部位將氟尿嘧啶植入劑均勻植入瘤床、腫瘤病灶區(qū)域、對應的腸系膜血管根部和相應淋巴回流區(qū)域，表面噴灑生物蛋白膠固定，植入范圍距吻合口至少4 cm以上，總劑量為600 mg；對照組行根治術(shù)后不植入任何藥物。2組均按《NCCN腫瘤學臨床實踐指南》的要求進行術(shù)后靜脈化療。2組臨床資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

Table 1 Comparison of clinical data between two groups表1 2組臨床資料比較 （n=32）

1.2 方法

1.2.1 標本制備 所有患者均于術(shù)前1 d和術(shù)后14 d清晨空腹時靜脈采血2 mL，置于EDTA抗凝管，4℃冰箱保存。

1.2.2 主要試劑 RNApure超純總RNA快速提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒均購于北京艾德萊生物科技有限公司。引物均由invitrogen公司合成。CD44var（v6）（FITC）標記的鼠抗人單克隆抗體購于eBioscience，陰性對照FITC Mouse IgG1,κ Isotype Ctrl購于BioLegend。檢測儀器采用美國BD公司生產(chǎn)的FACSAriaTMⅢ型流式細胞儀。氟尿嘧啶植入劑（散劑，商品名：中人氟安，蕪湖中人科技有限公司，批號20010826，規(guī)格100 mg/瓶）。

1.2.3 RT-PCR測定外周血survivin、caspase-3的表達 用紅細胞裂解液破壞紅細胞進行外周血單個核細胞富集。利用RNApure超純總RNA快速提取試劑盒提取外周血總RNA，RT-PCR擴增目的基因survivin、caspase-3和內(nèi)參基因β-ac?tin。引物序列：survivin 上游5＇-GTCCCTGGCTCCTCTACTG-3＇，下游5＇-GACGCTTCCTATCACTCTATTC-3＇，擴增長度 174 bp；caspase-3 上游 5＇-AGAACTGGACTGTGGCATTGAG-3＇，下游 5＇-GCTTGTCGGCATACTGTTTCAG-3＇，擴增長度 191 bp；β-actin 上游5＇-AGAGCCTCGCCTTTGCCGAT-3＇，下游5＇-TGCCAGATTTTCTCCATGTCGT-3＇，擴增長度 313 bp。sur?vivin、caspase-3及β-actin的擴增條件為：預變性94℃3 min，變性94℃ 30 s，退火55.2℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30次循環(huán)，終延伸72℃5 min。Marker長度為600 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色后，紫外燈下顯影拍照。

1.2.4 流式細胞儀測定外周血CD44V6的表達 2個1.5 mL的EP管分別取100 μL抗凝血樣本，A管加入10 μL抗體，B管加入0.5 μL同型對照，室溫25℃避光孵育30 min。兩管分別加入已配好的900 μL溶血素（用去離子水稀釋為1∶100），室溫25℃避光孵育30 min。直至肉眼可見溶血透明。4℃ 2 000 r/min離心10 min。棄上清，500 μL PBS重懸洗滌2次。300 μL PBS將細胞重懸后，過濾上機。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組內(nèi)比較用配對設計t檢驗，組間比較用完全隨機設計的兩樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血survivin和caspase-3的表達結(jié)果 術(shù)前2組survivin和caspase-3的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術(shù)后治療組和對照組survivin的表達均明顯低于術(shù)前，且治療組survivin的表達低于對照組（P＜0.05）；術(shù)后治療組和對照組caspase-3的表達均明顯高于術(shù)前，且治療組caspase-3的表達高于對照組（P＜0.05），見表2、圖1。

Table 2 The expressions of surviving and caspase-3 before and after surgery in two groups表2 各組手術(shù)前后survivin、caspase-3的表達 （x±s）

2.2 外周血CD44V6的表達結(jié)果 術(shù)前2組CD44V6的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術(shù)后治療組和對照組CD44V6的表達均明顯低于術(shù)前，且治療組CD44V6的表達低于對照組（P＜0.05）,見表3、圖2。

Table 3 The expression of CD44V6 before and after surgery in two groups表3 各組手術(shù)前后CD44V6的表達 （x±s）

Figure 2 The flow cytometry scatter plot of CD44V6 in two groups圖2 CD44V6的流式細胞術(shù)散點圖

3 討論

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡調(diào)控失衡發(fā)揮著重要作用。1997年Ambrosini等[4]首先分離出來了survivin基因，它是目前發(fā)現(xiàn)的最強的一種凋亡抑制因子，也是迄今為止唯一可通過內(nèi)源性抑制caspase活性而抑制細胞凋亡的因子。Shin等[5]研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期的G2/M階段，主要是由survivin抑制凋亡來保證正常的細胞分裂。它與caspase-3一起定位于中心體的微管上，可直接作用于caspase-3和caspase-7，并抑制其活性，從而引起細胞凋亡。研究表明，survivin可通過抑制癌細胞凋亡促進癌細胞增殖及腫瘤新生血管生成而在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而通過以survivin為靶點可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤的生長，也可加強化療藥物的作用[6-7]。本研究表明，氟尿嘧啶植入劑可通過明顯抑制survivin的表達，上調(diào)caspase-3的表達來促進腫瘤細胞凋亡，實現(xiàn)其治療惡性腫瘤的作用。

CD44V6為目前比較公認的腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因。它參與了3個腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程：腫瘤細胞與血管或淋巴管內(nèi)皮細胞之間、腫瘤細胞與基膜之間、腫瘤細胞穿出基膜與器官組成細胞之間的黏附。較多研究報道，CD44V6的高表達是腫瘤高侵襲、易轉(zhuǎn)移的指標[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌中CD44V6的高表達賦予癌細胞較強的侵襲轉(zhuǎn)移能力，可以作為預測大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的一個有效指標[10-11]。本研究結(jié)果顯示，2組術(shù)后14 d的CD44V6表達明顯低于術(shù)前，且治療組CD44V6的表達又低于對照組。筆者認為，氟尿嘧啶植入劑能夠在給藥區(qū)域長時間穩(wěn)定維持較高的藥物濃度，殺死術(shù)中未切除的殘留病灶、微小轉(zhuǎn)移灶及腹腔游離癌細胞，術(shù)中給藥可明顯降低術(shù)后大腸癌患者的復發(fā)及轉(zhuǎn)移，有助于改善其預后。

Figure 1 Electrophoresis of survivin and caspase-3 in two groups圖1 survivin和caspase-3的RT-PCR電泳圖

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