陳紹椿 尹躍平 戴秀芹 孫厚華 于瑞星 韓燕 陳祥生

·論著·

淋球菌對(duì)頭孢曲松的敏感性及淋球菌多抗原測(cè)序分型研究

陳紹椿 尹躍平 戴秀芹 孫厚華 于瑞星 韓燕 陳祥生

目的探討南京市淋球菌對(duì)頭孢曲松的敏感性以及相應(yīng)菌株的淋球菌多抗原測(cè)序分型(NGMAST)基因型別。方法2007年和2012年在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心臨床防治基地分別收集了204株和81株淋球菌,經(jīng)過分離純化及鑒定后,用瓊脂稀釋法測(cè)定其對(duì)頭孢曲松的最小抑菌濃度(MIC);菌株培養(yǎng)后利用試劑盒提取DNA,并進(jìn)行淋球菌多抗原測(cè)序分型(NG-MAST)。結(jié)果測(cè)試的285株淋球菌MIC≥ 0.060 μg/ml的菌株比例為63.2%,MIC≥ 0.125 μg/ml的比例為31.6%。2012年MIC≥ 0.060 μg/ml和MIC≥ 0.125 μg/ml的菌株比例分別為44.4%和11.1%,2007年MIC≥ 0.060 μg/ml和MIC≥ 0.125 μg/ml的菌株比例分別為70.6%和39.7%。NG-MAST分型研究顯示,285株淋球菌共有166個(gè)型別,菌株多樣性較高,其中73種為已知型別,93種為新型別。2007年測(cè)定的所有菌株中以ST568(n=13),ST270(n=9),ST421(n=7),ST2288(n=5),ST1731(n=4),ST1766(n=4),ST1866(n=4),ST1870(n=4)等為主。2012年測(cè)定的所有菌株中以ST2318(n=5),ST1053(n=4),ST5990(n=4),ST8726(n=4)為主。相同NG-MAST型別的菌株具有相同或相近的MIC值。 結(jié)論 2012年與2007年菌株的優(yōu)勢(shì)型別有較大變化,某些型別與頭孢藥敏值有較強(qiáng)對(duì)應(yīng)關(guān)系。NG-MAST分型可能作為分子生物學(xué)標(biāo)記用于淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)。

奈瑟球菌,淋病;抗藥性;頭孢曲松

淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)感染引起的淋病是常見性傳播疾病之一,該病可通過抗生素治愈,現(xiàn)在推薦使用頭孢曲松治療,由于抗生素的廣泛應(yīng)用,淋球菌本身又極易獲取外源耐藥基因,所以淋球菌對(duì)各種抗生素的耐藥性不斷增加,對(duì)頭孢曲松的敏感性不斷下降[1]。特別令人擔(dān)憂的是,近年來,

在日本[2]、法國(guó)[3]、西班牙[4]發(fā)現(xiàn)了對(duì)頭孢曲松高度耐藥的淋球菌菌株,即“超級(jí)淋球菌”,甚至還出現(xiàn)了臨床治療失敗的病例[2-3，5-10]。近20年耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示,淋球菌對(duì)頭孢曲松產(chǎn)生低敏的趨勢(shì)非?？?形勢(shì)嚴(yán)峻。淋球菌基因分型技術(shù)是現(xiàn)有追蹤耐藥菌株起源及傳播的有效方法之一,可了解淋球菌在特定時(shí)間和特定地域的遺傳和進(jìn)化。本研究對(duì)南京市收集的淋球菌臨床菌株進(jìn)行頭孢曲松最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定,用淋球菌多抗原測(cè)序分型技術(shù)(NG-MAST)對(duì)所有菌株進(jìn)行分型研究。

材料和方法

一、菌株收集及頭孢曲松MIC的測(cè)定

2007年和2012年在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心臨床防治基地分別收集了204株和81株淋球菌,經(jīng)過分離純化及鑒定后,用瓊脂稀釋法測(cè)定對(duì)頭孢曲松的MIC[11]。淋球菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分為每500 ml含18 g GC瓊脂粉(英國(guó)Oxoid公司),50 ml無菌脫纖維羊血(南京便診生物科技有限公司),培養(yǎng)基中頭孢曲松[世界衛(wèi)生組織(WHO)提供]濃度范圍為 0.008 μg/ml～ 0.500 μg/ml。 每批試驗(yàn)用已知MIC值的WHO標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行質(zhì)量控制(WHO G、WHO K、WHO L)。菌株完成MIC值測(cè)定后-70℃保存于脫脂牛奶管中。

二、DNA提取

菌株統(tǒng)一用淋球菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基復(fù)蘇后,刮取平板上菌落于200 μl磷酸緩沖液中混懸均勻,用比濁儀調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?。菌體DNA使用德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的QIAxtractor全自動(dòng)核酸純化儀提取DNA,所用試劑為儀器配套的QIAxtractor DX Kits。實(shí)驗(yàn)操作按照儀器說明書及提取液體樣本的試驗(yàn)方案進(jìn)行,方案如下：向200 μl菌懸液中加入120 μl DXL緩沖液,45℃振蕩加熱處理1 h。待樣本冷卻至室溫,1 000×g離心10 min。轉(zhuǎn)移300 μl上清至2000 μl樣本板中,進(jìn)行全自動(dòng)核酸純化。

三、NG-MAST分型

用Martin等文獻(xiàn)報(bào)道的方法[12],簡(jiǎn)述如下：PCR擴(kuò)增porB基因和tbpB基因,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,在正確位置有條帶的產(chǎn)物送至北京華大基因公司進(jìn)行純化測(cè)序。porB基因測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中已知序列(基因庫(kù)號(hào)M21289)進(jìn)行比對(duì),以M21289序列為參考,截取從第455位堿基開始的490 bp大小的基因片段進(jìn)入NG-MAST網(wǎng)站比對(duì)以獲取porB基因的等位基因型別;tbpB基因測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中已知序列(U65222)進(jìn)行比對(duì),以U65222序列為參考,截取從第1118位堿基開始的390 bp大小的基因片段進(jìn)入NG-MAST網(wǎng)站比對(duì)以獲取tbpB基因的等位基因型別;最后再綜合porB和tbpB基因的等位基因型別從NG-MAST網(wǎng)站獲取該菌株的基因型別。

結(jié) 果

一、頭孢曲松MIC值的分布

共檢測(cè)285株淋球菌,MIC測(cè)定的濃度范圍為 0.008 μg/ml～ 0.500 μg/ml, 有 1株菌 MIC 值為 0.500 μg/ml, 所有菌株中MIC≥ 0.060 μg/ml的菌株比例為 63.2%,MIC≥ 0.125 μg/ml比例為31.6%。兩年收集菌株的MIC值分布見表1。2012年MIC值集中于0.030(38.3%)和0.06(33.3%),MIC≥0.060 μg/ml的菌株比例為 44.4%(36/81),2007年MIC值集中于 0.030(24.0%)、0.060(30.9%)和0.125(32.4%),MIC≥0.060μg/ml的菌株比例為70.6%(144/204);2007年和 2012年 MIC ≥ 0.125 μg/ml的比例分別為39.7%(81/204)和11.1%(9/81),χ2檢驗(yàn)顯示兩年MIC≥ 0.125 μg/ml的比例,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.94,P＜0.01),見圖1。

二、NG-MAST型別分布

285株淋球菌共分出166個(gè)型別,菌株多樣性較高,其中73種為已知型別,93種為新型別。2007年共分出123個(gè)型別,其中54種為已知型別,69種為新型別,其中ST568(n=13),ST270(n=9),ST421(n=7),ST2288(n=5),ST1731(n=4),ST1766(n=4),ST1866(n=4),ST1870(n=4)為優(yōu)勢(shì)型別;2012年共分出52個(gè)型別,其中27種為已知型別,25種為新型別,其中ST2318(n=5),ST1053(n=4),ST5990(n=4),ST8726(n=4)為優(yōu)勢(shì)型別。

表1 2007年和2012年臨床分離的淋球菌菌株對(duì)頭孢曲松的MIC值分布(株)

圖1 2007年和2012年臨床分離淋球菌菌株對(duì)頭孢曲松在不同MIC值下的分布比例

表2 2007年和2012年特定優(yōu)勢(shì)型別對(duì)應(yīng)的頭孢曲松MIC值分布(例)

三、不同NG-MAST型別菌株頭孢曲松MIC值的分布

從表2中,可發(fā)現(xiàn)相同NG-MAST型別的菌株具有相同或相近的MIC值,一般跨度不超過3個(gè)濃度級(jí)。如 ST568,主要集中于 0.030 μg/ml和 0.060 μg/ml兩個(gè)濃度,ST270集中于 0.125 μg/ml濃度,而ST1766全部為0.060 μg/ml一個(gè)濃度,這些ST型別與頭孢曲松MIC值有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

討 論

我們一直對(duì)中國(guó)不同地區(qū)淋球菌耐藥趨勢(shì)進(jìn)行監(jiān)測(cè),根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,MIC≥ 0.060 μg/ml的淋球菌可以認(rèn)為是敏感性下降的菌株[13],結(jié)合已有的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示,1989—1990年MIC≥ 0.060 μg/ml的菌株比例為27.60%(21/76)[14],1999年為17.86%,到了2001年上升到50.00%[13],而我們的研究顯示,2007年MIC≥0.060 μg/ml菌株的比例為70.60%,2012年MIC≥ 0.060 μg/ml菌株比例為44.40%。從20世紀(jì)90年代至今,MIC≥ 0.060 μg/ml菌株的比例有較大變化,近年來更是保持較高比例。2007年有1株型別為ST2288的菌株,MIC為0.500 μg/ml,是否為耐藥菌株還需要進(jìn)一步確定,國(guó)際上現(xiàn)有報(bào)道的耐藥菌株也沒有此型別。兩年MIC≥0.125 μg/ml的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,2007年比2012年高,可能與兩年收集菌株的構(gòu)成差異較大有關(guān),我們的分子分型數(shù)據(jù)也顯示兩年菌株的型別差異較大。我們的研究發(fā)現(xiàn)某些ST型別與頭孢曲松MIC值有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,如ST568,ST270,ST1766,屬于這些型別的大部分菌株頭孢曲松MIC值集中于特定范圍內(nèi)。這樣的對(duì)應(yīng)關(guān)系對(duì)于追蹤特殊菌株(如耐藥菌株)的傳播有著重要意義,我們可以在某一特定區(qū)域內(nèi)建立菌株型別數(shù)據(jù)庫(kù),一旦出現(xiàn)特殊菌株,通過和本地區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),從而對(duì)其溯源。另外,在特定區(qū)域內(nèi),利用頭孢曲松MIC和ST型別之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,直接在臨床開展分子分型研究,從而快速判別其頭孢曲松MIC值的大致范圍是非常有意義的,但這需要建立起較為龐大的數(shù)據(jù)庫(kù),以提高其準(zhǔn)確性。

在本研究的NG-MAST分型實(shí)驗(yàn)中,分離出166個(gè)型別,說明南京市淋球菌的多樣性,而且其中有93種新型別,可能與NG-MAST數(shù)據(jù)庫(kù)中缺少中國(guó)地區(qū)相關(guān)數(shù)據(jù)有關(guān),為此,我們將所有新型別上傳至NG-MAST數(shù)據(jù)庫(kù),以豐富該數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)地區(qū)淋球菌型別的數(shù)據(jù)。2007—2012年菌株之間優(yōu)勢(shì)型別的差異表明,2007—2012年間南京市的淋球菌型別構(gòu)成有很大的變化,說明了時(shí)間上的跨度較大,該地區(qū)性網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了波動(dòng)。

[1] 蘇曉紅.淋球菌對(duì)廣譜頭孢菌素的耐藥性及應(yīng)對(duì)策略[J].中華皮膚科雜志，2013，46(5):301-304.

[2]Ohnishi M，Golparian D，Shimuta K，et al.IsNeisseria gonorrhoeaeinitiating a future era of untreatable gonorrhea?:detailed characterization ofthefirststrain with high-level resistance to ceftriaxone[J].Antimicrob Agents Chemother，2011，55(7):3538-3545.

[3]Unemo M，Golparian D，Nicholas R，et al.High-level cefiximeand ceftriaxone-resistantNeisseria gonorrhoeaein France:novel penA mosaic allele in a successful international clone causes treatment failure[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56(3):1273-1280.

[4]Camara J，Serra J，Ayats J，et al.Molecular characterization of two high-level ceftriaxone-resistantNeisseria gonorrhoeaeisolates detected in Catalonia，Spain[J].J Antimicrob Chemother，2012，67(8):1858-1860.

[5]Ison CA，Hussey J，Sankar KN，et al.Gonorrhoea treatment failures to cefixime and azithromycin in England，2010[J].Euro Surveill，2011，16(14):19833.

[6]Unemo M，Golparian D，Hestner A.Ceftriaxone treatment failure of pharyngeal gonorrhoea verified by international recommendations，Sweden，July 2010[J].Euro Surveill，2011，16(6):19792.

[7]Unemo M，Golparian D，Syversen G，et al.Two cases of verified clinical failures using internationally recommended first-line cefixime for gonorrhoea treatment，Norway，2010[J].Euro Surveill，2010，15(47):19721.

[8]Heymans R，Bruisten SM，Golparian D，et al.Clonally relatedNeisseria gonorrhoeaeisolates with decreased susceptibility to the extended-spectrum cephalosporin cefotaxime in Amsterdam，the Netherlands[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56(3):1516-1522.

[9]Tapsall J，Read P，Carmody C，et al.Two cases of failed ceftriaxone treatmentin pharyngealgonorrhoea verified by molecular microbiological methods[J].J Med Microbiol，2009，58(Pt 5):683-687.

[10]Yokoi S，Deguchi T，Ozawa T，et al.Threat to cefixime treatment for gonorrhea[J].Emerg Infect Dis，2007，13(8):1275-1277.

[11]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-first informational supplement[M].Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)，2011.

[12]Martin IM，Ison CA，Aanensen DM，et al.Rapid sequence-based identification of gonococcal transmission clusters in a large metropolitan area[J].J Infect Dis，2004，189(8):1497-1505.

[13]Su XH，Jiang FX，Dai XQ，et al.Surveillance of antimicrobial susceptibilities inNeisseria gonorrhoeaein Nanjing，China，1999-2006[J].Sex Transm Dis，2007，34(12):995-999.

[14]Ye SZ.Survey on antibiotic sensitivity ofNeisseria gonorrhoeaestrains isolated in China，1987-1992[J].Sex Transm Dis，1994，21(4):237-240.

2013-04-25)

(本文編輯：吳曉初)

Ceftriaxone susceptibility testing and multi-antigen sequence typing ofNeisseria gonorrhoeaestrains isolated in 2007 and 2012 from Nanjing,China

Chen Shaochun，Yin Yueping，Dai Xiuqin，Sun Houhua，Yu Ruixing，

Han Yan，Chen Xiangsheng.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;National Center for Sexually Transmitted Disease Control，China Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210042，China

Yin Yueping，Email:yinyp@ncstdlc.org

ObjectiveTo test the ceftriaxone susceptibility ofNeisseria gonorrhoeae(NG)isolates from Nanjing city，and to assess their genotypes by using the NG multi-antigen sequence typing(NG-MAST)method.MethodsA total of 204 NG strains isolated in 2007 and 81 in 2012 from Nanjing city were included in this study.The minimum inhibitory concentration(MIC)of ceftriaxone was determined for these strains using an agar dilution method.DNA was extracted by the Qiagen commercial kit from these strains followed by NG-MAST.Results All the isolates were susceptible to ceftriaxone(MIC，≤ 0.25 μg/ml).The MIC of ceftriaxone was ≥ 0.06 μg/ml for 63.2%of all the NG strains，70.6%of those isolated in 2007 and 44.4%of those in 2012，and ≥ 0.125 μg/ml for 31.6%of all the NG strains，39.7%of those isolated in 2007，11.1%of those in 2012.Totally，166 genotypes were identified among the 285 isolates，of which，73 had been reported，and 93 were previously unreported.The most prevalent genotype was ST568(n=13)in NG strains isolated in 2007，followed by ST270(n=9)，ST421(n=7)，ST2288(n=5)，ST1731(n=4)，ST1766(n=4)，ST1866(n=4)，ST1870(n=4)，while ST2318(n=5)，ST1053(n=4)，ST5990(n=4)，ST8726(n=4)were the common genotypes in 2012.Those isolates with identical or similar genotypes tended to display similar MICs for ceftriaxone.ConclusionsThe prevalent genotypes of NG are markedly different between 2007 and 2012 in Nanjing region，and there is a strong association between the genotypes and ceftriaxone susceptibility of NG.NG-MAST results may serve as a genetic marker in the surveillance of antibiotic susceptibility in NG.

Neisseria gonorrhoeae;Drug resistance;Ceftriaxone

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.003

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81101294);協(xié)和青年基金(3332013143)

210042南京,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心

尹躍平,Email：yinyp@ncstdlc.org