蔡 梟，安 洪，胡庭義， 陳 瀟， 范 偉

(重慶醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 骨科, 重慶 400016)

研究論文

不同載荷運動對去勢雌性大鼠骨關節(jié)軟骨形態(tài)學及代謝的影響

蔡 梟，安 洪，胡庭義， 陳 瀟， 范 偉*

(重慶醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 骨科, 重慶 400016)

目的研究不同載荷情況下運動對去勢大鼠骨關節(jié)軟骨形態(tài)學和代謝方面的影響。方法SD大鼠在成功制備為骨質疏松模型后，隨機分為安靜組、低載荷運動組、中載荷運動組和高載荷運動組，各10只進行跑臺運動；運動3個月后處死大鼠，收取膝關節(jié)標本及血液，進行大鼠血清相關物質的檢測，進行關節(jié)軟骨形態(tài)學(HE染色、番紅O染色、甲苯胺染色)檢查及免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白含量。結果形態(tài)學及血清檢測結果表明，中載荷運動組有利于維持關節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)(Plt;0.05)；而與安靜組、低載荷和中載荷運動組相比較，高載荷運動組則不利于關節(jié)軟骨的生長，使關節(jié)軟骨出現退變樣改變(Plt;0.05)。結論不同載荷運動對大鼠膝關節(jié)軟骨的影響不同，適度載荷運動對預防和治療骨質疏松有較好的臨床指導意義。

骨質疏松; 骨關節(jié)軟骨; MMP-3；Ⅱ型膠原蛋白

骨質疏松是以骨量減少、骨組織顯微結構破壞、骨強度減低而易發(fā)生骨折的一種全身性疾病，以絕經后的婦女多發(fā)[1]。研究已經表明運動可以改善絕經期患者骨量、骨密度和強度，并且能夠有效預防骨質疏松[2- 4]。

適度運動是維持正常關節(jié)軟骨形態(tài)結構及生理功能的必要條件，過度運動導致關節(jié)軟骨退變[5- 6]。當關節(jié)軟骨發(fā)生變化時，軟骨基質中膠原等成分表達和分泌均發(fā)生變化[7]。

近些年來，預防和治療骨質疏松癥的研究越來越受到關注，運動是提高骨密度和預防骨質疏松癥的重要手段之一。本實驗通過對處于骨質疏松的大鼠給予不同強度的載荷運動干預，觀察對骨質疏松大鼠骨代謝指標及骨組織形態(tài)的影響，以期為運動手段預防骨質疏松提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級雌性SD大鼠40只[體質量 290～340 g，重慶醫(yī)科大學動物醫(yī)學中心，SYXK(渝)2012- 0001]，8周齡，平衡膳食1周，5%水合氯醛 (7 mL/kg)經腹腔給麻醉，切除雙側卵巢。3個月后經雙能X線檢測骨密度，證實骨質疏松模型制備成功。隨機分為：去勢安靜組(OVX,n=10)、去勢低載荷運動組(low-loading OVX-RUN，L，n=10)、去勢中載荷運動組(medium-loading OVX-RUN，M,n=10)、去勢高載荷運動組(high-loading OVX-RUN,H,n=10)分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 實驗試劑：免疫組化SP試劑盒(北京中杉金橋生物工程有限公司)；鈣、磷試劑盒、 II 型膠原鼠抗兔多克隆抗體和 MMP-3 Elisa 試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 運動方案： 在正式實驗開始前1周每天在跑步機中以慢速(10～15 m/min)跑步30 min，以適應跑道。正式實驗后，運動方案參照文獻[8- 9]運動處方稍做改進,建立不同的運動載荷模型，最大負重(218±10)g，每次運動1 h，6 d/周，共計12周(表1)。

1.2.2 軟骨厚度測量： 使用帶刻度萊卡顯微鏡進行手工測量，每張切片從最厚到最薄平均取6個不同的厚度進行測量，測量從軟骨表面到鈣化層的厚度，結果用μm表示。

表1 不同運動載荷模型Table 1 Different loading exercise model

1.2.3 血清ELISA檢測MMP-3水平:運動12周后，以水合氯醛注射腹腔麻醉，打開胸腔，從心尖部進針抽血5 mL，低溫2 000 r/min離心15 min，收集上清液，置-80 ℃保存。ELISA法測定血清MMP-3濃度。

1.2.4 番紅-O染色: 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，于0.1%番紅-O染液染色。在光鏡下(×400)下由兩位獨立觀察者按Mankin評分標準進行評分，取兩者均值作為最終得分。

1.2.5 甲苯胺藍染色:石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，經甲苯胺藍染色后。在光鏡下(×400)觀察骨與軟骨細胞的形態(tài)變化。

1.2.6 Ⅱ型膠原蛋白含量測定:按Ⅱ型膠原蛋白試劑盒所示方法測定，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，高倍鏡(×400)下選定單位面積，測定單位面積Ⅱ型膠原蛋白平均吸光度值。

1.2.7 血清中離子測定:血清鈣(Ca)測試方法采用的是甲基百里香酚藍比色法，通過比色與同樣處理的鈣標準進行比較，可計算出鈣的含量。血清磷(P)測試方法采用的是孔雀綠直接顯色法，在一定范圍內，顏色深度與含量成正比。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 組織學結果

2.1.1 HE染色：安靜組軟骨表面平滑，軟骨細胞呈圓形或是橢圓形位于軟骨陷窩內，排列較規(guī)則(圖1A)；低載荷運動組軟骨細胞增多，細胞排列規(guī)則(圖1B)；中載荷運動組較低載荷運動組軟骨細胞明顯增多，排列規(guī)則(圖1C)；高載荷運動組軟骨表面不規(guī)則，軟骨細胞減少明顯，鈣化層可見大量肥大的軟骨細胞，并且伴有血管翳形成(圖1D)。

2.1.2 番紅O染色：安靜組軟骨表面光滑，軟骨細胞呈圓形或者橢圓形，基質番紅O染色均勻，染色較淡呈紫色(圖2A)；低載荷運動組細胞增多，染色深(圖2B);中載荷運動組細胞數目及染色較前兩組增加，可見清晰的潮線(圖2C)；高載荷運動組可見軟骨表面欠規(guī)則，移形層及放射層細胞數減少，潮線不規(guī)則，鈣化層出現肥大細胞(圖2D)。

2.1.3 甲苯胺藍染色：安靜組軟骨細胞排列欠規(guī)則(圖3A)；低載荷運動組細胞數目明顯增多，排列規(guī)則，可見潮線(圖3B);中載荷運動組細胞數目明顯增多，排列規(guī)則，潮線規(guī)則(圖3C)；高載荷運動組染色較淺，軟骨細胞數目減少，細胞排列也欠規(guī)則，潮線消失(圖3D)。

2.2免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白及Ⅱ型膠原蛋白平均吸光度值

安靜組軟骨基質染色呈棕黃色，主要分布于軟骨表層及放射層(圖4A)；低載荷運動組基質染色較深，主要分布于表層及放射層(圖4B)；中載荷運動組較其他組明顯加深，細胞數目較多(圖4C)；高載荷運動組可見染色較其他組減少，細胞數目減少(圖4D)。與OVX組比較，M組Ⅱ型膠原蛋白平均吸光度值明顯升高(Plt;0.01)，H組吸光度值則明顯降低(Plt;0.01)(表2)。

圖1 各組關節(jié)軟骨HE染色情況的差異Fig 1 Differences among groups of articular cartilage HE dyeing(×400)

圖2 各組關節(jié)軟骨番紅O染色差異Fig 2 Differences among groups of articular cartilage sarranine O dyeing(×400)

圖3 各組關節(jié)軟骨甲苯胺藍染色情況的差異Fig 3 Differences among groups of articular cartilage Toluidine blue dyeing(×400)

groupaverageopticaldensityoftypeⅡcollagenOVX 0.03±0.00L 0.03±0.01M 0.04±0.01*#H 0.02±0.00*#

*Plt;0.01 compared with OVX；#Plt;0.05 compared with L.

2.3 各組大鼠血清鈣、磷濃度

與OVX組相比，L、M組鈣、磷含量明顯降低，H組含量明顯增高(Plt;0.05)。與L組相比，M組鈣、磷含量也明顯較低(Plt;0.05)(表3)。

表3 血清鈣、磷濃度

*Plt;0.01，**Plt;0.05 compared with OVX；#Plt;0.01；##Plt;0.05 compared with L.

2.4 各組大鼠關節(jié)軟骨厚度、Mankin評分

L、M組關節(jié)軟骨厚度較OVX組明顯增厚(Plt;0.01),H組的軟骨厚度則明顯減少。M組的Mankin評分與L組比較明顯較低，H組的Mankin評分則明顯升高(Plt;0.01)(表4)。

2.5 血清中MMP-3濃度

與OVX組相比較,L、M組MMP-3含量明顯較低(Plt;0.05)；與L組相比較，M組MMP-3的含量未見明顯變化,而H組的MMP-3的含量則明顯增高(Plt;0.01)(表5)。

表4 關節(jié)軟骨厚度、Mankin評分

*Plt;0.01，**Plt;0.05 compared with OVX；#Plt;0.01；##Plt;0.05 compared with L.

表5 血清中MMP-3濃度Table 5 Expression of MMP-3 in blood (±s，n=10)

*Plt;0.01,**Plt;0.05 compared with OVX；#Plt;0.01，##Plt;0.05 compared with L.

3 討論

本實驗通過采用均為正常年齡的雌性大鼠模擬骨質疏松的模型來研究不同載荷運動對骨關節(jié)軟骨形態(tài)學及代謝的影響，而老年的大鼠由于存在雌激素水平的降低導致骨量的丟失，會對實驗結果產生影響。

本實驗低載荷及中載荷運動可以降低大鼠血清中的鈣、磷、MMP-3的含量，尤其以中載荷更為明顯，證明適宜載荷運動可以降低血鈣、磷及MMP-3的含量,對骨代謝產生了有益的作用，促進了骨骼的礦化。這與目前多數研究結果“大鼠運動后血清中鈣及MMP-3的濃度明顯減少”。同時低、中載荷可以增加關節(jié)軟骨的厚度，Mankin評分則較低。而高載荷運動的軟骨厚度明顯降低，Mankin評分則明顯較高。結果均表明高載荷運動組對關節(jié)軟骨產生負面的效應，而中載荷運動組有利于維持骨關節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)。

細胞外基質的主要成分包括Ⅱ型膠原和蛋白聚糖聚集物,二者的轉換和降解失衡時，導致關節(jié)軟骨發(fā)生降解，最終出現關節(jié)軟骨的破壞[10- 11]。Ⅱ型膠原免疫組化結果提示,低、中載荷運動組對維持關節(jié)軟骨的形態(tài)是有利的,而高載荷運動組對關節(jié)軟骨的形態(tài)產生負作用，出現了關節(jié)軟骨的破壞。

基于上述研究結果，低載荷和中載荷運動為利于大鼠關節(jié)軟骨生存的“安全窗口”。運動對機體的影響是雙向的，最終結果取決于負荷大小。適度的主動運動對于關節(jié)軟骨具有保護作用，而且在一定運動負荷內，運動的強度越大則表現出更好的效果，過度的運動負荷可使骨性關節(jié)炎的發(fā)生率更高，而中等以下強度的運動有益于軟骨的健康。本研究結果證實不同的力學負荷對關節(jié)軟骨的影響不一，適宜的力學負荷在改善骨質疏松狀況的情況下，有利于骨關節(jié)軟骨的健康，而過度的力學負荷不僅不利于骨質疏松的改善，而且還導致關節(jié)軟骨的破壞。

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Effect of different loading exercise on morphology and metabolism of articular cartilage in ovariectomized female rats

CAI Xiao, AN Hong, HU Ting-yi, CHEN Xiao, FAN Wei*

(Dept. of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

ObjectiveTo investigate the influence of loading exercise on morphology and metabolism of articular cartilage in ovariectomized rats.MethodsForty female Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 4 groups: ovariectomized (OVX), ovariectomized plus low loading exercise (low loading OVX-RUN), ovariectomized plus medium loading exercise (medium OVX-RUN), ovariectomized plus high loading exercise (high loading OVX-RUN); After 12 weeks, the following variables were compared among the 4groups. Knee joint and blood samples were collected; Test of rat serum related material were carried on the articular cartilage morphology (HE dyeing, sarranine O dyeing, toluidine) examination and immunohistochemical staining to detect the content of type Ⅱ collagen in articular cartilage.ResultsMedium OVX-RUN group was helpful to maintain the steady state of articular cartilage (Plt;0.05). Compared with OVX,low loading OVX-RUN group and medium OVX-RUN group, high loading OVX-RUN group was not conducive to the growth of the articular cartilage,induce the degenerative-like changes in articular cartilage(Plt;0.05).ConclusionsThe different loading exercise has different effect on the cartilage of rats, moderate loading exercise on the prevention and treatment of osteoporosis has useful clinical significance.

osteoporosis; articular cartilage；matrix metalloproteinase-3；type Ⅱ collagen

2014- 01- 16

2014- 04- 12

*通信作者(correspondingauthor)：fanweicqmu@163.com

1001-6325(2014)06-0792-05

R 322.7+1

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