樂(lè)文靜 蘇曉紅 李賽 劉玉榮 張津萍 朱小鳳 王寶璽

巢式聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)男性尿道炎患者尿液中陰道毛滴蟲(chóng)

樂(lè)文靜 蘇曉紅 李賽 劉玉榮 張津萍 朱小鳳 王寶璽

目的建立兩種巢式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法檢測(cè)男性尿道炎患者尿液中陰道毛滴蟲(chóng)感染狀況,評(píng)價(jià)兩種巢式PCR在臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法2011年4月至2013年12月來(lái)我院性病門(mén)診就診的1 088例男性尿道炎患者為研究對(duì)象,收集尿道拭子標(biāo)本做分泌物涂片鏡檢、陰道毛滴蟲(chóng)濕片檢測(cè)以及淋球菌培養(yǎng),同時(shí)收集尿液標(biāo)本提取DNA,針對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)重復(fù)基因組和β微管蛋白基因,采用兩種巢式PCR法檢測(cè)尿液中陰道毛滴蟲(chóng)。結(jié)果濕片法檢測(cè)陰道毛滴蟲(chóng)的陽(yáng)性率為0,而兩種巢式PCR法均檢測(cè)出29例陽(yáng)性標(biāo)本,陽(yáng)性率為2.67%,且兩種巢式PCR法檢測(cè)出的陽(yáng)性標(biāo)本一致。結(jié)論與濕片法相比,巢式PCR法檢測(cè)男性尿液標(biāo)本陰道毛滴蟲(chóng)具有較高的靈敏度和特異性。

尿道炎;毛滴蟲(chóng),陰道;聚合酶鏈反應(yīng)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道[1],2008年陰道毛滴蟲(chóng)病新發(fā)病例僅西太平洋地區(qū)就達(dá)4.57千萬(wàn),其中男性2.38千萬(wàn)。目前實(shí)驗(yàn)室檢查毛滴蟲(chóng)的方法主要為濕片法,但敏感性低,且易受檢驗(yàn)者水平的影響。培養(yǎng)法雖然是診斷毛滴蟲(chóng)感染的金標(biāo)準(zhǔn),但操作麻煩,耗時(shí)較長(zhǎng),故不作為臨床常規(guī)檢查[2-3]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法對(duì)尿拭子或尿液標(biāo)本均具有較高的敏感性和特異性[4-5],但巢式PCR與普通PCR法相比,通過(guò)設(shè)計(jì)外引物和內(nèi)引物,對(duì)目的基因進(jìn)行兩輪特異性擴(kuò)增,可進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和特異性[6]。鑒于以上原因,本研究參考相關(guān)文獻(xiàn),建立了兩種巢式PCR方法,對(duì)男性尿道炎患者的尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),以期為臨床陰道毛滴蟲(chóng)的檢測(cè)提供行之有效的方法。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

2011年4月至2013年12月,在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院性病門(mén)診就診的有尿道炎臨床表現(xiàn)的男性患者1 088例。病例選擇標(biāo)準(zhǔn):年齡≥18歲,有尿道分泌物和(或)尿痛,就診前未應(yīng)用抗滴蟲(chóng)藥物。本研究通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書(shū)。

二、主要試劑與儀器

淋球菌TM培養(yǎng)基(珠海迪爾生物工程有限公司),DNA提取液(美國(guó)Epicentre公司),PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司],核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)[生工生物工程(上海)股份有限公司],瓊脂糖(美國(guó)Life Technologies公司)。S1000型PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司),高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

三、方法

1.標(biāo)本采集:每例患者采集2根尿道拭子標(biāo)本,1根用于分泌物涂片鏡檢和淋球菌培養(yǎng),另1根用于陰道毛滴蟲(chóng)濕片鏡檢[7];采集長(zhǎng)時(shí)間(1 h以上)未排尿后的首段尿或清晨首次尿5～10 ml,分裝成1 ml/管后于-80℃保存,用于DNA提取。

2.陰道毛滴蟲(chóng)濕片法檢測(cè):將采集的拭子直接涂在滴有生理氯化鈉溶液的載玻片上,蓋上蓋玻片,用100倍、400倍顯微鏡觀察。

3.DNA提取:將-80℃凍存的尿液置37℃解凍,4℃離心3 min(12 000 r/min,離心半徑9.5 cm)。棄上清液后加200 μl DNA提取液,充分渦旋15 s,置65℃金屬浴15 min。再渦旋15 s,97℃金屬浴5 min。取出冷卻后離心取上清進(jìn)行PCR檢測(cè)。

4.巢式PCR引物設(shè)計(jì):TVC巢式PCR引物參考文獻(xiàn)[6],以陰道毛滴蟲(chóng)重復(fù)基因組為目的基因,擴(kuò)增片段約237 bp;BTuBx巢式PCR引物以陰道毛滴蟲(chóng)β微管蛋白為目的基因,參考文獻(xiàn)[8]并運(yùn)用Primer Premier 5.0生物軟件自行設(shè)計(jì),擴(kuò)增片段約134 bp。兩種陰道毛滴蟲(chóng)巢式PCR引物序列見(jiàn)表1。

5.PCR檢測(cè):配制50 μl PCR擴(kuò)增體系,10×PCR 緩沖液(Mg2+Plus)5 μl,dNTPs(各 10 mmol/L)1 μl,引物(TVC3F/TVC4R 或 BTuBx1-Fa/BTuBx1-Ra)各 1 μl,Taq 酶(5 U/μl)0.25 μl,DNA 模板 5 μl,其余體積用滅菌蒸餾水補(bǔ)齊。每次檢測(cè)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(經(jīng)測(cè)序及BLAST比對(duì)驗(yàn)證序列正確的PCR陽(yáng)性男性尿液DNA)、陰性對(duì)照(無(wú)菌蒸餾水)。取0.5 μl第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為DNA模板,引物(TVC11F/TVC12R 或 BTuBx3-F/BTuBx3-Ra)各 1 μl,其余成分同上,進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。第1輪或第2輪PCR擴(kuò)增過(guò)程相同,均包括40個(gè)循環(huán):95℃變性1 min,52～55℃退火1 min,72℃延伸1 min。瓊脂糖凝膠電泳:配制2%瓊脂糖凝膠,加入1%EB溶液,制成約4 mm厚的瓊脂板,于電泳槽中電泳。電泳液為1×TAE溶液,電壓120 V,每孔上樣量10 μl。電泳后將瓊脂板置于紫外線下觀察,拍照記錄結(jié)果,擴(kuò)增出相應(yīng)大小目的條帶即為陽(yáng)性(圖1)。

表1 陰道毛滴蟲(chóng)巢式PCR引物序列

6.核酸序列測(cè)定及分析:將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至北京博邁德生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定,得到的核酸序列與GenBank中已知目的基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Fisher精確概率法檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩種巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

兩種巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析以及BLAST比對(duì),與GenBank中預(yù)期片段序列相似性達(dá)98%以上。

二、兩種巢式PCR法及濕片法的比較

圖1 陰道毛滴蟲(chóng)巢式PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜 M:DNA Marker;1～3:待測(cè)標(biāo)本;4:陽(yáng)性對(duì)照;5:陰性對(duì)照;A:TVC巢式PCR結(jié)果;B:BTuBx巢式PCR結(jié)果

采用兩種巢式PCR法及濕片法分別檢測(cè)了1 088例男性尿道炎患者尿液,結(jié)果濕片法的檢出率為0,而兩種巢式PCR法均檢測(cè)出29例陽(yáng)性標(biāo)本,陽(yáng)性率為2.67%,且兩種巢式PCR法檢測(cè)出的陽(yáng)性標(biāo)本一致。以并聯(lián)法計(jì)算各實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度,即只要有一種方法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性即認(rèn)定該標(biāo)本為陽(yáng)性,濕片法靈敏度為0,兩種巢式PCR法靈敏度均為100%。以串聯(lián)法計(jì)算兩種巢式PCR法的特異度,即只有當(dāng)兩種巢式PCR均檢測(cè)為陽(yáng)性時(shí)才認(rèn)定該標(biāo)本為陽(yáng)性,兩種巢式PCR法的特異性均為100%。經(jīng)Fisher精確概率法檢驗(yàn)分析,兩種巢式PCR法檢出率分別與濕片法比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

討 論

陰道毛滴蟲(chóng)病是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的性傳播疾病。但由于檢測(cè)技術(shù)的限制,以及超過(guò)77.3%的男性感染者無(wú)明顯臨床癥狀[9],使得人們習(xí)慣上認(rèn)為該病是女性陰道炎的常見(jiàn)病因,而對(duì)男性感染者的診斷與治療常常被忽視。我國(guó)性病門(mén)診中男性陰道毛滴蟲(chóng)檢出率0～10.09%[10-12]。何康[13]對(duì)215例滴蟲(chóng)性陰道炎女患者的男性配偶尿道分泌物進(jìn)行陰道毛滴蟲(chóng)濕片鏡檢,陽(yáng)性率高達(dá)20%。

姚志遠(yuǎn)等[5]曾以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn),證實(shí)PCR法對(duì)尿道拭子或尿道液標(biāo)本均具有較高的敏感性和特異性。我們首次運(yùn)用巢式PCR法進(jìn)行男性尿道炎中陰道毛滴蟲(chóng)的檢測(cè)。巢式PCR法與普通PCR法相比,通過(guò)設(shè)計(jì)外引物和內(nèi)引物,對(duì)目的基因進(jìn)行兩輪特異性擴(kuò)增,大大提高了檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和特異性,尤其是對(duì)于臨床含有大量人體正?；蚨≡w含量過(guò)少的標(biāo)本,更是減少了漏檢的概率。本研究中巢式PCR檢測(cè)出29例陽(yáng)性標(biāo)本,第1輪PCR的陽(yáng)性檢出率僅為55.17%～58.62%(TVC引物及BTuBx引物第1輪分別檢出陽(yáng)性標(biāo)本17例、16例,該數(shù)據(jù)未在上述結(jié)果中列出)。本研究中濕片法陽(yáng)性檢出率為0。表明巢式PCR法與濕片法、普通PCR法相比,具有更高的靈敏度和特異性。

陰道毛滴蟲(chóng)雖然不是男性尿道炎的常見(jiàn)原因,對(duì)于有尿道炎癥狀的男性患者如果經(jīng)驗(yàn)性治療沒(méi)有效果,有條件時(shí)應(yīng)做滴蟲(chóng)檢測(cè)。濕片法雖然快速簡(jiǎn)便,但其敏感性低,增加了臨床漏檢的可能性,宜推廣靈敏度和特異性均高的PCR法檢測(cè)男性標(biāo)本中的陰道毛滴蟲(chóng)。

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2014-03-19)

(本文編輯:顏艷)

Detection ofTrichomonas vaginalisin male patients with urethritis by nested PCR

Le Wenjing，Su Xiaohong，Li Sai，Liu Yurong，Zhang Jinping，Zhu Xiaofeng，Wang Baoxi.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

Su Xiaohong，Email:suxhong@yahoo.com

ObjectiveTo establish two nested PCR assays for detection ofTrichomonas vaginalisin urine samples from male patients with urethritis，and to evaluate their diagnostic value.MethodsOne thousand and eighty-eight male patients with urethritis were enrolled from sexually transmitted disease(STD)clinic in the Hospital of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College between April 2011 and December 2013.Urethral swabs were collected followed by smear testing，wet mount microscopic examination ofTrichomonas vaginalis，and cultivation ofNeisseria gonorrhoeae.Urine specimens were also obtained from these patients followed by DNA extraction.Two nested PCR assays were developed and performed to amplify the repeat genomic sequence and β-tubulin gene ofTrichomonas vaginalis.ResultsTrichomonas vaginaliswas detected in none of these swab specimens by wet mount microscopy，but in 29(2.67%)of the urine specimens by either of the two nested PCR assays.Moreover，the positive specimens detected by the two nested PCR assays were completely consistent.ConclusionCompared with wet mount microscopy，nested PCR has higher sensitivity and specificity in detection ofTrichomonas vaginalisin urine samples from male patients.

Urethritis;Trichomonas vaginalis;Polymerase chain reaction

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.004

美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)國(guó)際合作項(xiàng)目(1-U19-AI084048)

210042南京,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所

蘇曉紅,Email:suxhong@yahoo.com