Genistein對Aβ所致癡呆大鼠工作記憶的影響及機(jī)制探討

原 麗 郭小姝 解 瑞 劉曉杰 李清山 劉 燕 張翠英

1.山西長治醫(yī)學(xué)院生理教研室，山西長治 046000；2.長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院眼科，山西長治 046000

來源于大豆的異黃酮類物質(zhì)染料木黃酮（Genistein）又稱金雀異黃素，其結(jié)構(gòu)特與相對分子量均與17β-雌二醇（E2）的結(jié)構(gòu)相似，與雌激素受體β 具有較高的親和力，被稱為植物雌激素[1]。因而被認(rèn)為低劑量的Genistein 可能是雌激素替代治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的有效措施。體外研究也發(fā)現(xiàn)，低劑量Genistein 可通過激活A(yù)kt 誘導(dǎo)Nrf2 活性，從而降低淀粉樣肽誘導(dǎo)的神經(jīng)元降解，改善Aβ1-40 所致的癡呆模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶的損傷[2]。高劑量的Genistein 可以產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞毒作用，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]；但不同濃度Genistein 對癡呆模型大鼠工作記憶的具體影響如何及其可能的機(jī)制還未見報道。β 淀粉樣肽( β-amyloid peptides，Aβ)在腦內(nèi)沉積是阿爾茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，最終患者出現(xiàn)進(jìn)行性的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能障礙[4]。故該實(shí)驗(yàn)通過側(cè)腦室注射Aβ1-40 制備AD 模型大鼠，觀察不同劑量的Genistein 對AD 模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶和工作記憶的影響，并探討其可能的機(jī)制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及給藥

3月齡的健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(230±30)g50 只，由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。Genistein 和Aβ1-40 試劑均購于美國Sigma 公司產(chǎn)品，Aβ1-40 溶于0.9%的生理鹽水，Genistein溶于0.5%二甲基亞砜(DMSO)，SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)后，固定暴露顱骨，參照腦立體定位圖譜，側(cè)腦室給藥；Genistein 灌胃1 次/d，堅(jiān)持4 周。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

隨機(jī)將SD 大鼠分為5 組：0.9%生理鹽水組、0.5% DMSO 溶劑組、25 nmol Aβ1-40 組、2.0 mg/kg Genistein+Aβ1-40 組、20 mg/kg Genistein+Aβ1-40。

1.3 Y 迷宮測試

Y 迷宮由3 個等長互為120°角的臂組成,隨機(jī)定為A、B、C 區(qū)。實(shí)驗(yàn)時將大鼠放入1 個臂的末端,讓其自由出入3 個臂,記錄持續(xù)8 min，并記錄大鼠進(jìn)入各區(qū)的次序和總次數(shù)（N），以連續(xù)進(jìn)入3 個不同的臂為1 次正確交替反應(yīng),記錄正確交替反應(yīng)次數(shù)。自發(fā)交替反應(yīng)率(%)=[正確交替反應(yīng)次數(shù)/(N-2)]×100。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，5 組大鼠斷頭處死、取腦，并分離出海馬組織進(jìn)行超聲勻漿、提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄為cDNA、然后采用Real time PCR 以GAPDH 為內(nèi)參檢測海馬組織中STAT3 和Caspase-3 的mRNA 相對表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)具體見表1。

表1 PCR 實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析的Tukey HSD 法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠短期工作記憶能力的比較

該研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表2），各組大鼠在8 min 的自發(fā)交替試驗(yàn)中進(jìn)入Y 迷宮3 個臂的總次數(shù)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01），表明藥物的給予并沒有影響動物的自發(fā)活動。但與正常對照組相比較，Aβ1-40 組大鼠自發(fā)交替反應(yīng)率明顯降低（P=0.000 1），0.5%DMSO 溶劑組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)；與Aβ1-40 組相比，Genistein 低劑量組（2 mg/kg）大鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率顯著增加（P=0.000），高劑量組（20 mg/kg）大鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。

表2 各組大鼠Y 迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)[n=10，（±s）]

表2 各組大鼠Y 迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)[n=10，（±s）]

注：各組與正常對照組相比，**P<0.01;各組與Aβ1-40 相比，##P<0.01。

組別進(jìn)臂總次數(shù)自發(fā)交替反應(yīng)率(%)P 值（與對照組比較）對照組0.5%DMSO 組25 nmol Aβ1-40 組2.0 mg/kg Genistein+Aβ1-40 組20.0 mg/kg Genistein+Aβ1-40 組28.50±3.10 26.70±3.95 86.08±3.45 84.40±2.87-0.789 27.90±4.04（68.96±6.17）**0.000 27.45±3.64 25.89±3.24（85.53±6.83）##67.55±4.78 0.981 0.000 P 值（Aβ1-40 組比較）---0.000 0.780

2.2 各組大鼠海馬組織STAT3 和Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量的比較

如圖1A所示，正常對照組中，STAT3 和Caspase-3 的mRNA相對表達(dá)量分別是（0.99±0.03）和（1.0±0.02）,0.5%DMSO 組則分別是（0.97±0.05）與（1.01±0.06），兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01），但與對照組相比，Aβ1-40 組STAT3 mRNA 相對表達(dá)量顯著下降（0.79±0.04，P<0.01），Caspase-3 的mRNA 相對表達(dá)量卻明顯升高（1.25±0.06）；圖1B 顯示，給予低劑量Genistein(2 mg/kg)長期處理后，與Aβ1-40 組相比較，STAT3mRNA 的相對表達(dá)量升至（0.96±0.03）（P<0.01），Caspase-3 的mRNA 相對表達(dá)量降至（1.0±0.05）(P<0.01)，高劑量Genistein(20 mg/kg)長期處理并無顯著改善，STAT3 和Caspase-3 mRNA 的相對表達(dá)量分別是（0.70±0.02）和（1.28±0.05）（P>0.01）。

圖1 各組大鼠海馬組織STAT3 和Caspase-3mRNA 相對表達(dá)量A：0.5%DMSO 溶劑組和25nmol Aβ1-40 組與對照組中mRNA 相對表達(dá)量的比較，**P<0.01 vs 對照組；B：不同劑量Genistein 治療組與Aβ1-40 組中STAT3 和Caspase-3 的mRNA 相對表達(dá)量比較，##P<0.01 vs Aβ1-40 組。

3 討論

Genistein 是異黃酮類物質(zhì)中活性最高的一種，與E2R 結(jié)合后表現(xiàn)出雌激素樣作用，但同時也具有抗雌激素樣作用[5]。而該研究結(jié)果顯示，長期低劑量Genistein 灌胃后可拮抗Aβ1-40 所產(chǎn)生的神經(jīng)毒作用，但高劑量的Genistein 并沒有改善Aβ1-40所導(dǎo)致大鼠海馬認(rèn)知功能障礙。Maryam 等[6]的研究表明Genistein預(yù)處理后可以改善Aβ1-40 所誘導(dǎo)大鼠短期的空間辨別記憶障礙。這與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常相似，我們的Y-迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，長期低劑量的Genistein 治療后可以拮抗Aβ1-40 的神經(jīng)毒作用，逆轉(zhuǎn)大鼠工作記憶的損傷，這是對Maryam 等研究的完善與補(bǔ)充，同時該研究還發(fā)現(xiàn)，高劑量的Genistein 處理后，與Aβ1-40 組相比較，自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)百分率并沒有改善，提示，高劑量的Genistein 并不能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[7-8]，高劑量的Genistein 可以促發(fā)原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元的凋亡和壞死，從而影響神經(jīng)元的功能，Choi[3]的在體實(shí)驗(yàn)也表明，雄性SD 大鼠長期攝取高劑量的Genistein 后，腦組織勻漿中乳酸脫氫酶含量明顯升高，誘發(fā)細(xì)胞毒作用。有報道稱低劑量的Genistein 可以發(fā)揮雌激素受體β 激動劑效應(yīng)，拮抗Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，但高濃度的Genistein 可以作為蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)的抑制劑，研究PTK 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，Genistein 作為PTK 抑制劑有效減弱神經(jīng)保護(hù)肽[Gly14]-humanin(HNG)拮抗Aβ31-35 所致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的保護(hù)作用[10]。我們推測低劑量的Genistein 可能表現(xiàn)雌激素樣作用，而高劑量的Genistein 主要行駛PTK 抑制劑的功能來調(diào)節(jié)PTK的信號轉(zhuǎn)到作用。

Genistein 不同劑量對抗Aβ1-40 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用中所表現(xiàn)出不同的生物學(xué)作用的分子機(jī)制依然有待探索，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT3）是STAT 家族成員之一，可以在許多信號轉(zhuǎn)到通路中發(fā)揮作用，負(fù)責(zé)將細(xì)胞外信號最終傳遞至細(xì)胞核，通過誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，分化和凋亡從而影響炎癥與腫瘤的形成[11]。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位，Caspase-3 作為Caspase 家族成員之一，則是細(xì)胞凋亡進(jìn)程中的執(zhí)行者，是最主要的終末剪切酶，發(fā)揮著不可替代的作用[12]。該研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的Genistein 組海馬組織中STAT3 的mRNA 相對表達(dá)量均明顯降低，Caspase-3 的相對mRNA 的表達(dá)量均顯著上升；低劑量的Genistein 處理組有效逆轉(zhuǎn)Aβ1-40 誘導(dǎo)的海馬組織內(nèi)STAT3 和Caspase-3 基因表達(dá)的改變。綜上所述，我們認(rèn)為，STAT3/Caspase-3 可能是Aβ1-40 和Genistein 發(fā)揮功能的共同靶點(diǎn)，STAT3 mRNA 的上調(diào)以及Caspase-3 表達(dá)的壓抑是低劑量Genistein 拮抗Aβ1-40 神經(jīng)毒性作用的分子機(jī)制，而高劑量Genistein 卻表現(xiàn)出相反的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。

該研究通Y 迷宮實(shí)驗(yàn)探討了不同劑量Genistein 對大鼠神經(jīng)功能的不同影響，并利用real-time PCR 實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)一步明確不同劑量Genistein 在體內(nèi)可能的分子機(jī)制，通過對Genistein 多重功能的實(shí)驗(yàn)研究來補(bǔ)充完善Genistein 生理機(jī)制，為臨床的雌激素替代法治療神經(jīng)退行性疾病如AD 提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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