宿根婆婆納‘達爾文之藍’的組培脫毒和快繁技術

魏進莉

摘 要：將供試品種的帶莖尖和腋芽的莖段，用70%酒精浸泡30 s，然后用20%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，無菌水沖洗4次，消毒處理后剝?nèi)?.1～0.3 mm的莖尖，接種于以MS為基本培養(yǎng)基添加6-BA、IAA、NAA等外源激素的培養(yǎng)基中，研究了不同條件對愈傷組織誘導芽形成和芽繼代增殖、生根和移栽效果的影響。結果表明，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA 1.0 mg·L-1和IAA0.5 mg·L-1為較適宜的外植體誘導愈傷組織和愈傷組織誘導芽的培養(yǎng)基。最佳繼代增殖培養(yǎng)基為6-BA2.0 mg·L-1和NAA0.1 mg·L-1。最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS添加NAA0.2 mg·L-1和IAA1.0 mg·L-1。25 d后，組培苗移栽成活率達到98%以上。

關鍵詞：宿根花卉；莖尖剝離；愈傷組織；芽誘導；玻璃化

中圖分類號：S336 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.009

婆婆納‘達爾文之藍（Veronica'Darwin's Blue'）為玄參科婆婆納屬多年生草本植物，株高30～35 cm，花期5～10月，藍色花，是近幾年從國外引進，適宜我國北方地區(qū)的優(yōu)良宿根花卉，耐寒、耐旱及瘠薄土壤[1-3]，主要用于園林綠化中布置花壇、花境，以彌補夏秋季花卉稀少的現(xiàn)狀，主要通過常規(guī)的無性扦插和分株方式來繁殖。但在栽培繁殖過程中發(fā)現(xiàn)，隨著繁殖次數(shù)和栽植年限的增加，出現(xiàn)了植株的長勢和花的品質(zhì)越來越差的嚴重退化現(xiàn)象[4-7]，從而使繁殖率大大降低，很難滿足市場供應，甚至一物難求。針對此問題，可利用植物組織培養(yǎng)技術，進行脫毒復壯和快速繁殖，以提供大量優(yōu)質(zhì)種苗，但目前關于宿根婆婆納‘達爾文之藍和同屬品種的莖尖剝離組織培養(yǎng)及脫毒復壯快繁技術尚未見報道。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 外植體 以帶莖尖和腋芽的莖段為材料，由北京花木有限公司宿根花卉基地提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類和不同濃度水平的外源激素[8-9]， 愈傷組織和叢生芽誘導、增殖培養(yǎng)基添加綿白糖30 g·L-1，瓊脂粉4.5 g·L-1；生根培養(yǎng)基添加綿白糖20 g·L-1，瓊脂粉5.0 g·L-1。各培養(yǎng)基均為pH值5.8～6.0，121 ℃下，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 培養(yǎng)條件 光照強度3 000 lx，光照時間12 h，溫度（24±2） ℃。增殖和生根培養(yǎng)與此相同。

1.2 方 法

取宿根婆婆納‘達爾文之藍帶莖尖和腋芽的幼嫩莖段，長2～3 cm，剪去葉片，用柔軟的毛刷蘸取洗衣粉水輕輕刷洗干凈，用流水沖洗0.5～1 h。在超凈工作臺上，用70%的酒精浸泡30 s，再用20%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min，用無菌水沖洗4次，待用。

1.2.1 莖尖剝離誘導愈傷組織和叢生芽 在超凈工作臺上，將已消毒的外植體材料在生物解剖鏡下，剝?nèi)?.1～0.3 mm大小的莖尖[10]，接種于培養(yǎng)基上：①6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1；②6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1；③6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1； ④6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1； ⑤6-BA1.0 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1；⑥6-BA1.0 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1；⑦6-BA2.0 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1；⑧6-BA2.0 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1。每瓶培養(yǎng)基接1個莖尖，每種培養(yǎng)基20個重復，共160瓶。培養(yǎng)30 d時，觀察記錄結果。

1.2.2 繼代增殖培養(yǎng) 將莖尖誘導所得叢生芽剪切成2 cm左右?guī)?～3個腋芽的段，接種到增殖培養(yǎng)基上：①6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1；②6-BA1.0 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1；③6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1；④6-BA2.0 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1。每種培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶8株，30 d觀察記錄結果。

1.2.3 生根培養(yǎng) 將株高2～3 cm帶有4～6個葉片的無根壯苗，轉(zhuǎn)接到以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加①NAA0.2 mg·L-1， ②NAA0.2 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1，③NAA0.4 mg·L-1，④NAA0.4 mg·L-1 +IAA1.0 mg·L-1的生根培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶15株，進行生根培養(yǎng)，20 d觀察統(tǒng)計結果。

1.2.4 移栽煉苗 將培養(yǎng)20 d的生根苗移到溫室，擰松瓶蓋煉苗3～5 d，將苗從培養(yǎng)瓶中取出，清洗干凈根部的培養(yǎng)基，栽到裝有基質(zhì)（優(yōu)質(zhì)草炭+蛭石+珍珠巖=3∶1∶1）的128孔穴盤上，25 d觀察統(tǒng)計結果。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織和叢生芽的誘導

在宿根婆婆納‘達爾文之藍的莖尖誘導愈傷組織和叢生芽的過程中，發(fā)現(xiàn)外源激素的種類及濃度對愈傷組織和芽的形成都有著不同程度的影響。細胞分裂素（即6-BA）的濃度高時，愈傷組織和芽的形成相對較多，但易造成玻璃化；生長素NAA濃度高時，不利于芽的形成和生長，?；瘒乐?；生長素IAA濃度高時，有利于芽的形成和生長。具體情況見表1。

由表1中可看出，在8種添加了不同激素種類和濃度水平的培養(yǎng)基中，愈傷組織和芽形成的多少及百分率、玻璃化現(xiàn)象的存在、芽苗的株高和健壯程度都有所不同，并且存在著明顯的差異。其中以編號為⑥的培養(yǎng)基表現(xiàn)性狀最好，⑤和⑧較好，⑦次于⑤和⑧，①和③較差，②很差，④最差。

2.2 繼代增殖

繼代增殖培養(yǎng)基的設計，以莖尖誘導愈傷組織和芽的結果為參考依據(jù)。在繼代增殖培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)激素種類和濃度不同對芽增殖的影響也有所不同，并且與芽誘導的結果較為一致。6-BA濃度高時有利于芽的形成，IAA濃度高時有利于苗的生長。6-BA與NAA配比時更有利于芽的增殖培養(yǎng)，而與IAA配比時有利于壯苗培養(yǎng)。具體情況見表2。

由表2可看出，編號為③的培養(yǎng)基增值系數(shù)最高，從整體情況來看為最好的增殖培養(yǎng)基；④次之，增殖系數(shù)略低一點，但苗較高壯一些，且有老化生根現(xiàn)象；①和②相對較差，增值系數(shù)低。

2.3 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)基的設計，以增殖培養(yǎng)結果為參考依據(jù)。在生根培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)激素種類和濃度對根的形成有著很大影響。單獨使用NAA時，不利于根的形成，且當NAA濃度增高時，苗基部產(chǎn)生較多愈傷組織，使根的形成嚴重受阻；當將NAA與IAA結合使用時，情況較好。具體情況見表3。

由表3可看出，編號為②的培養(yǎng)基中生根情況最好，生根率達到100%，根的數(shù)量較多，苗基部產(chǎn)生的愈傷組織很少，有利于移栽成活。①和④較差，生根率相對較低，根的數(shù)量也相對較少，不利于移栽成活。③最差，生根率不到半數(shù)，根數(shù)少且苗基部愈傷組織形成較多，很不利于移栽成活。

2.4 移栽煉苗

宿根婆婆納‘達爾文之藍的生根苗在移栽25 d時根已滿穴，株高10 cm左右，苗健壯有分枝形成，成活率達到98%以上。

3 討 論

3.1 玻璃化現(xiàn)象形成的影響因素

在增殖培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，當溫度升高時，易形成玻璃化苗，尤其當溫度高于24 ℃時，隨著溫度的升高玻璃化苗的數(shù)量明顯增多；當溫度降低時，玻璃化現(xiàn)象減少或無?；?，但苗的生長緩慢。另外，在相同溫度條件下，當細胞分裂素6-BA和生長素NAA的濃度增加時，易形成玻璃化苗。當兩種因素同時存在時，玻璃化現(xiàn)象加重。玻璃化程度較輕時，在溫度條件適宜時會恢復成好苗；而玻璃化嚴重時，無法恢復，會慢慢褐化死亡。玻璃化苗的產(chǎn)生，使苗增殖擴繁和生根培養(yǎng)的數(shù)量與質(zhì)量都受到影響。尤其是在大量擴繁生產(chǎn)時，應注意避免玻璃化苗的形成，以提高苗的生根率和質(zhì)量，有效降低成本。

3.2 影響生根率和根數(shù)量的因素分析

在生根培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，除了激素影響苗的生根率和根的數(shù)量外，苗的老幼程度和是否玻璃化也影響生根率和根的數(shù)量。苗越大，越易生根，根的數(shù)量和生根率都較高；反之，相對較低。玻璃化苗不易生根，甚至不生根。在大量生產(chǎn)時，在生根培養(yǎng)前，根據(jù)苗的生長狀況，可進行一次壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)基中的激素濃度可適當降低一些，這樣有利于提高生根率和縮短生根培養(yǎng)時間，有效降低成本。

3.3 莖尖培養(yǎng)脫毒效果的分析

婆婆納‘達爾文之藍在常規(guī)無性繁殖栽培過程中，出現(xiàn)了退化現(xiàn)象，其表現(xiàn)癥狀為：葉皺縮，分枝減少，植株矮小，花量減少，花期短，植株枯死。此退化現(xiàn)象嚴重地影響了其觀賞性和栽培繁殖。經(jīng)莖尖剝離培養(yǎng)出的芽苗，葉片恢復正常，移栽后很快形成分枝，達到了脫毒壯苗的效果。但由于各種因素，未進行專業(yè)的病毒檢測工作。

4 結 論

綜上所述，莖尖剝離誘導愈傷組織和芽形成的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1，在此培養(yǎng)基中芽形成的數(shù)量和苗的生長情況最好；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1，在此培養(yǎng)基中苗的增值系數(shù)和生長情況相對優(yōu)于其它3種培養(yǎng)基；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.2 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1，在此培養(yǎng)基中苗的生根率和生根數(shù)量明顯高于其它3種培養(yǎng)基；生根苗移栽煉苗容易成活，25 d時成活率達98%以上；適宜的培養(yǎng)溫度為22～24 ℃。

參考文獻：

[1] 尤靜. 宿根花卉在園林綠化中的應用研究[J].太原科技，2010（2）：82-83，86.

[2] 王麗云，張偉英.宿根花卉在包頭市園林綠化中的運用[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2012（1）：95.

[3] 沈可東，朱富榮，張高訓，等.花卉在園林綠化美化建設中的作用[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2012（1）：93-94.

[4]劉敏.花卉組織培養(yǎng)與工廠化生產(chǎn)[M].北京：地質(zhì)出版社，2002.

[5] 康黎芳，李永平，曹冬梅，等.安祖花組培快繁體系的建立[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2013（9）：899-903.

[6] 黃象男，臧新，呂曉輝，等.蝴蝶蘭組培快繁技術研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2008（1）：91-93，109.

[7] 高凱，潘永.牡丹組織培養(yǎng)繁殖技術初探[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2010（5）：60-61.

[8] 李浚明.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學出版社，1991.

[9] 史向遠，王秀紅，田良才，等.串葉松香草組培快繁技術研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2011（1）：17-20.

[10] 曹孜義，劉國民.實用植物組織培養(yǎng)技術教程[M].蘭州：甘肅科學出版社，1996.