何剛偉

(西南科技大學(xué)信息工程學(xué)院,四川綿陽 621010)

三維熒光光譜法識別魚毒性藻類的可行性研究

何剛偉

(西南科技大學(xué)信息工程學(xué)院,四川綿陽 621010)

提出了快速識別分析藻類的熒光檢測的方法——三維熒光光譜法,以典型的無毒和魚毒性藻類為研究對象,實驗驗證了三維熒光光譜法識別分析魚毒性藻類的可行性。采用日立F-4600熒光分光光度計對典型藻類進行譜圖測量,研究結(jié)果表明:無毒性藻類和魚毒性藻類的三維譜圖形狀有較大差異,三維熒光光譜法識別分析魚毒性藻類是可行的。該技術(shù)可以在不需要對樣品進行復(fù)雜預(yù)處理的條件下進行測試,這對實現(xiàn)海洋藻類實時、在線、現(xiàn)場測量具有重要的意義。

三維熒光光譜法 快速檢測 魚毒性藻類 識別分析

近年來，魚毒性赤潮災(zāi)害頻發(fā)，對海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，影響我國近岸養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展。魚毒性藻類是引發(fā)魚毒性赤潮的一類有毒海藻，它能產(chǎn)生對魚類毒性極強的溶血毒素，這種毒素是大多數(shù)有毒藻類產(chǎn)生的一類毒素。它可在短時間內(nèi)造成大量養(yǎng)殖魚類死亡[1-4]。但此類赤潮毒素尚無對人類造成危害的報道。如海洋卡盾藻(C.marina)等可以產(chǎn)生溶血性毒素及其他可導(dǎo)致魚類死亡的魚毒素。目前對魚毒性藻類的識別檢測大體上可以劃分為基于形態(tài)學(xué)差異的圖像識別技術(shù)、基于核酸分析的檢測方法、基于免疫分析的檢測方法、基于化學(xué)生物標志物(如色素) 的方法和基于光學(xué)特性的方法等幾個方面并沒有一種快速準確的技術(shù)[5]，傳統(tǒng)的藻細胞顯微觀察費時費力，不能有效達到識別效果。

三維熒光技術(shù)作為近年來快速發(fā)展的新型化學(xué)分析手段，具有靈敏度高、選擇性強、樣品所需前處理簡單、測定速度快、測定成本低、易于自動化等優(yōu)點適用于大量浮游藻類樣品的快速分析，也適用于現(xiàn)場的實時監(jiān)測[6]。本文探討了三維熒光光譜法識別魚毒性藻類的可行性。該研究對有效開展赤潮災(zāi)害的應(yīng)急管理、提高養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益，促進經(jīng)濟發(fā)展具有十分重要的意義。

圖1 Dn-EX

圖2 Dn-EM

1 實驗部分

1.1 儀器和分析條件

采用日立F-4600熒光分光光度計。

儀器參數(shù)：光譜帶寬：激發(fā)：1.0，2.5，5.0，10.0nm發(fā)射：1.0，2.5，5.0，10.0，20.0nm；響應(yīng)時間：可達40ms；光源：150w Xe燈，高強度的光源為200-900nm波長范圍內(nèi)的測定提供充足的光能；監(jiān)視器：光電管；檢測器：光電倍增管。

1.2 試劑和樣品處理

將各個藻種用符號標記，如D1代表海洋卡盾藻，以此方便后面曲線的繪制。各個符號與藻種的對應(yīng)關(guān)系如表1、表2所示。

圖3 Wn-EX

圖4 Wn-EM

藻種均取自暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心藻種室。將自然海水使用0.45μm微孔濾膜過濾于錐形瓶中，121℃、15psi下滅菌25min，冷卻到室溫。用f/2改良配方配制培養(yǎng)液，接種藻液后置于人工氣候箱中培養(yǎng)。溫度25℃，光照強度60μmol m-2s-1，光暗循環(huán)L：D＝12：12。每組設(shè)三個平行樣，以一個平行樣為訓(xùn)練集，另兩個平行樣為測試集。每天固定時間取樣于顯微鏡下用0.1mL浮游植物計數(shù)框進行藻細胞計數(shù)，繪制生長曲線，確定藻類的生長期。

圖5 Dn+Wn-EM

圖6 Dn+Wn-EX

表1 魚毒性藻種Table.1 ichthyotoxic microalgae species

表2 無毒性藻種Table.2 non-toxic microalgae species

2 二維熒光光譜對比與結(jié)論

以下圖1到圖6為各個藻種的2維熒光光譜對比圖，縱軸是熒光相對強度，橫軸是激發(fā)或者發(fā)射波長。其中圖例下面的EM指的是激發(fā)光譜，EX指的是發(fā)射光譜。為了圖文展現(xiàn)的直觀性，每兩幅圖后面附上對比結(jié)論。

(1) 四種魚毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖1所示，其激發(fā)譜圖形狀及其特征激發(fā)基本一致。

(2) 四種魚毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖2所示，其發(fā)射譜圖形狀及其特征發(fā)射基本一致。

(3) 不能通過二維光譜數(shù)據(jù)對魚毒性藻類進行區(qū)分。

(4) 四種無毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖3所示，其激發(fā)譜圖形狀及其特征激發(fā)基本一致。

(5) 四種無毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖4所示，其發(fā)射譜圖形狀及其特征發(fā)射基本一致。

(6)不能通過二維光譜數(shù)據(jù)對無毒性藻類進行區(qū)分。

(7) 四種魚毒性藻類和4種無毒性藻類的發(fā)射譜圖如圖5所示，其激發(fā)譜圖形狀及其特征激發(fā)基本一致。

(8)四種魚毒性藻類和4種無毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖6所示，其發(fā)射譜圖形狀及其特征發(fā)射基本一致。

(9)不能通過二維光譜數(shù)據(jù)對魚毒性藻類和無毒性藻類進行區(qū)分。

圖7 D1-3D

圖8 D2-3D

圖9 D3-3D

圖10 D4-3D

圖11 W1-3D

圖12 W2-3D

圖13 W3-3D

圖14 W4-3D

3 三維熒光光譜對比與結(jié)論

以下圖7到圖14為所選取的8種藻類(4種為無毒性，4種為魚毒性)的三維熒光光譜圖，橫軸和縱軸分別為激發(fā)和發(fā)射波長，豎軸為相對熒光強度。圖例中的3D代表三維譜圖，其中圖7到圖10為魚毒性藻類，圖11到圖14為無毒性藻類。對比結(jié)論附于圖后。

圖7到圖10四種魚毒性藻類的三維圖譜形狀基本上一致，都是在激發(fā)波長660nm-680nm，發(fā)射波長500nm-540nm之間存在一個突出的熒光峰。而圖11到圖14的四種無毒性藻類形狀則明顯不同。圖11在激發(fā)波長700nm-720nm，發(fā)射波長400nm-500nm存在熒光峰，圖12在激發(fā)波長720nm-740nm，發(fā)射波長440nm-460nm存在一個低的熒光峰。圖13在激發(fā)波長700nm-720nm，發(fā)射波長400nm-460nm存在低的熒光峰。圖14熒光峰的位置位于激發(fā)波長700nm-720nm，發(fā)射波長440nm-460nm。

從三維圖直觀來看，無毒性藻類與魚毒性藻類的三維譜圖在形狀上相差較大，因此結(jié)合譜圖峰值位置數(shù)據(jù)的差異性與譜圖形狀的區(qū)別性完全可以達到識別的效果，實現(xiàn)三維熒光法對魚毒性藻類的識別分析。

4 結(jié)論和展望

通過以上熒光譜圖對比發(fā)現(xiàn)，無毒藻類和魚毒性藻類的二維譜圖沒有明顯差別，然而其三維譜圖在形狀上相差較大，這說明通過三維熒光光譜技術(shù)對魚毒性藻類的識別分析是可行性的。桓清柳等人利用小波分析法建立了識別魚毒性藻類的數(shù)學(xué)模型，為藻類定量分析提供了便利[7，8]，隨著激光技術(shù)、探測器技術(shù)以及化學(xué)計量學(xué)的發(fā)展，三維熒光光譜技術(shù)能夠在未知條件下進行各待測物定性定量分析，可用于藻類的現(xiàn)場檢測，也可推廣到其他實際環(huán)境中物種識別分析。

致謝：在此對暨南大學(xué)能夠提供藻種和實驗條件謹致謝意！

[1]Ling C,Trick C G,Harmful Algae,2010,9(5):522.

[2]江天久,佟蒙蒙,齊雨藻.赤潮的分類分級標準及預(yù)警色設(shè)置[J].生態(tài)學(xué)報,2006,26(6):2035-2040.

[3]José-Luis Giner,Hui Zhao, Carmelo Tomas.Sterols and fatty acids of three harmful algae previously assigned as Chattonella[J].Phytochemistry,2008,69:2167-2171.

[4]桓清柳.具溶血活性的魚毒性藻類的三維熒光光譜識別研究[D].暨南大學(xué),2013.

[5]于志剛,米鐵柱,姚鵬,甄毓.赤潮藻鑒定與定量檢測方法進展[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2009,39(5):1067-1076.

[6]陳國珍,黃賢智.熒光分析法[M].北京:科學(xué)出版社,第二版,1990:23-94.

[7]桓清柳,黃翔,吳霓,江濤,江天久.魚毒性藻類及其溶血活性的三維熒光光譜識別研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2013,33(2):399-403.

[8]Zhang F,Su RG,HEJF.Phycological Society Of America,2010,46,403.

何剛偉(1990—),男,陜西咸陽人,西南科技大學(xué)信息工程學(xué)院碩士研究生,主要從事熒光檢測技術(shù)研究.