血清NETs、FIB、miR-374a-5p水平與膝關節(jié)置換術后下肢深靜脈血栓形成的相關性分析

張新瑞，張珍露，丁帥，張振，王振

下肢深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)是膝關節(jié)置換術后常見并發(fā)癥，術后下肢DVT 發(fā)生率為40%～60%，深靜脈造影是DVT 診斷金標準，但其屬于有創(chuàng)性檢查，且操作過程較為復雜，血清學指標檢測操作簡便，已成為臨床輔助診斷DVT 的常見方法[1]。中性粒細胞胞外陷阱(NETs)是由組蛋白、中性粒細胞內顆粒組成，可結合血管性血友病因子(VWF)、凝血因子Ⅻ(FⅫ)，促進纖維蛋白形成，促使血小板凝集，抑制其表達后可減少靜脈血栓形成[2]。纖維蛋白原(FIB)對血管內凝血、血栓形成具有一定預測價值[3]。微小RNA(miRNA)表達失調與DVT 等多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關，微小RNA-374a-5p(miR-374a-5p)在混合型DVT 中表達水平升高，其高表達可加重DVT 嚴重程度[4]。目前膝關節(jié)置換術后下肢DVT與血清NETs、FIB、miR-374a-5p 相關研究報道相對較少，因此，本研究主要探討膝關節(jié)置換術后下肢DVT 者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平變化，分析其對術后下肢DVT 的預測價值，為臨床診治工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年9 月至2023 年5 月于鄭州陽城醫(yī)院進行膝關節(jié)置換術患者108 例為研究對象，其中男73 例，女35 例；年齡49～78 歲，平均年齡(63.29±7.02)歲；體質量指數(shù)18～30 kg/m2，平均體質量指數(shù)(24.01±2.61)kg/m2；原發(fā)疾?。簞?chuàng)傷性膝關節(jié)炎48 例、類風濕性膝關節(jié)炎43 例、膝關節(jié)壞死13 例、滑膜軟骨瘤4 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(審批號：YCYY20200815001)，且簽署知情同意書。

1.2 選取標準 納入標準：符合膝關節(jié)置換術治療指征者；未伴有凝血功能異常者；未接受抗凝治療者；既往未接受下肢血管手術者；未伴有明顯出血性傾向；單側肢體發(fā)病者；病程<15 d。排除標準：圍手術期出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸道感染者；新冠肺炎感染者；長期使用免疫調節(jié)劑者；術后傷口紅腫或淺表感染者；術前存在下肢DVT者；既往心腦血管梗阻病史者；合并活動性下肢潰瘍者。

1.3 方法

1.3.1 治療方法及分組標準 研究對象予以膝關節(jié)置換術治療，且依據(jù)參考文獻進行手術操作[5]。術后予以抗凝、抗血栓等常規(guī)治療。依據(jù)術后7 d是否發(fā)生下肢DVT 分為DVT 組、非DVT 組，DVT 標準[6]：壓迫遠端肢體后，超聲未檢測到病變處血流信號；靜脈管內徑擴寬，施加壓力后管腔未完全壓縮；靜脈管腔內徑變寬，且可見不同回聲實性包塊。

1.3.2 收集臨床資料 收集研究對象臨床資料，包括性別、年齡、手術時間、術中失血量、止血帶應用時間、體質量指數(shù)、靜脈血栓栓塞癥風險評估量表(Caprini)評分、基礎疾病、原發(fā)疾病，其中Caprini 評分包括40 個有關血栓形成的危險因素，每個危險因素依據(jù)嚴重程度分別記為1、2、3、4、5分，分值越高則DVT 發(fā)生風險越高[7]。

1.3.3 檢測血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平分別于術前、術后1 d、術后3 d 采集兩組研究對象空腹外周靜脈血5 mL，室溫靜置30 min 后以3 500 r/min 離心10 min 分離血清，采用MPO-DNA復合物的捕獲ELISA 法檢測血清NETs 水平(上?；钌锕咎峁?。采用ACL7000 全自動凝血分析儀及其配套檢測試劑盒(美國貝克曼庫爾特公司)檢測血清FIB 水平。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血清miR-374a-5p 水平：采用Trizol法(美國Invitrogen 公司)提取血清中總RNA，參照miRNA 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(上海澤葉生物科技有限公司)合成cDNA，以cDNA 為模板進行qRT-PCR 擴增，實驗操作過程參照SYBR Green SuperReal 熒光定量預混試劑增強版(北京天根生化公司)，采用StepOne TM 熒光定量分析儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)檢測獲取數(shù)據(jù)，以U6 為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-374a-5p 水平。miR-374a-5p 引物由北京寶日醫(yī)生物技術公司設計合成，miR-374a-5p正向引物5’-GCCGGTTATAATACAACCTGATAAG-3’，反向引物5’-TATGGTTGTTCTCTGCTCTGTCTC-3’；U6 正向引物5’-CAGCACATATACTAAAATTGGAAC G-3’，反向引物5’-ACGAATTTGCGTGTCATCC-3’。

1.4 觀察指標 ①對比分析兩組術前、術后1 d、術后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平，并分析其與Caprini 評分相關性。②分析術后下肢DVT發(fā)生的影響因素，并評價術后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平對下肢DVT 發(fā)生的預測效能。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 分析數(shù)據(jù)，計量資料符合正態(tài)分布且以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率[n(%)]表示，兩組間比較采用χ2檢驗；Pearson 法相關性分析血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平與Caprini 評分相關性；多因素Logistic 回歸分析術后下肢DVT 發(fā)生的影響因素；繪制受試者工作特征曲線(ROC)，并計算ROC 下面積(AUC)，評價不同血清指標預測下肢DVT 發(fā)生的價值，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料比較 術后7 d 下肢DVT發(fā)生率為29.63%(32/108)。兩組在性別、手術時間、術中失血量、止血帶應用時間、體質量指數(shù)、基礎疾病、原發(fā)疾病方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。DVT 組年齡、Caprini 評分高于非DVT 組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較[n(%)，(±s)]

表1 兩組患者臨床資料比較[n(%)，(±s)]

注：DVT=下肢深靜脈血栓形成，Caprini=靜脈血栓栓塞癥風險評估量表，下同。

臨床參數(shù)性別DVT 組(n=32)非DVT 組(n=76)統(tǒng)計值0.028 P 值0.868 DVT 組(n=32)非DVT 組(n=76)統(tǒng)計值P 值男女年齡/歲手術時間/min術中失血量/mL止血帶應用時間/min體質量指數(shù)/(kg·m-2)Caprini 評分/分22(68.75)10(31.25)65.21±6.07 122.63±20.87 244.19±51.32 63.26±11.08 23.65±2.08 7.22±1.62 51(67.11)25(32.89)62.48±5.72 126.27±22.09 238.57±55.63 65.28±12.71 24.16±3.05 3.16±0.93 2.224 0.795 0.490 0.782 0.864 16.404 0.028 0.429 0.625 0.436 0.390<0.001臨床參數(shù)基礎疾病高血壓糖尿病高脂血癥原發(fā)疾病創(chuàng)傷性膝關節(jié)炎類風濕性膝關節(jié)炎膝關節(jié)壞死滑膜軟骨瘤12(37.50)10(31.25)9(28.13)19(25.00)17(22.37)15(19.74)1.719 0.947 0.917 1.076 0.190 0.330 0.338 0.783 14(43.75)13(40.63)3(9.38)2(6.25)34(44.74)30(39.47)10(13.16)2(2.63)

2.2 兩組患者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平比較 術前兩組血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后1 d、術后3 d 兩組血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平高于術前；術后1 d、3 d DVT 組血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平高于非DVT 組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平比較(±s)

表2 兩組患者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平比較(±s)

注：NETs=中性粒細胞胞外陷阱，F(xiàn)IB=纖維蛋白原，miR-374a-5p=微小RNA-374a-5p，下同；與術前比較，*P<0.05；與術后1 d 比較，#P<0.05。

組別DVT 組非DVT 組t 值P 值例數(shù)32 76 NETs(吸光度)術前0.20±0.04 0.21±0.05 1.003 0.318 FIB/(g·L-1)miR-374a-5p術后1 d 0.56±0.10*0.37±0.08*10.444<0.001術后3 d 0.45±0.11*#0.36±0.10*4.145<0.001術前2.23±0.44 2.18±0.51 0.484 0.630術后1 d 5.96±0.61*3.31±0.53*22.675<0.001術后3 d 4.62±0.64*#3.28±0.76*8.747<0.001術前1.00±0.06 1.01±0.04 1.015 0.312術后1 d 2.85±0.41*1.88±0.42*11.036<0.001術后3 d 2.41±0.50*#1.83±0.56*5.067<0.001

2.3 術前血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平與Caprini 評分相關性分析 Pearson 法相關性分析顯示術前血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平與Caprini評分呈正相關(P<0.05)，見表3。

表3 術前血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平與Caprini 評分相關性分析

2.4 多因素Logistic 回歸分析術后下肢DVT 發(fā)生的影響因素 多重共線性診斷結果顯示術后1 d、術后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平可能存在多重共線性，術后1 d 創(chuàng)傷、疼痛等可引起應激反應，這可能影響血清指標水平變化，因而剔除術后1 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平。以是否發(fā)生術后下肢DVT 為因變量(否=0、是=1)，以年齡、Caprini 評分及術后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平為自變量進行Logistic 逐步回歸分析，結果顯示，Caprini 評分、術后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平為術后下肢DVT 發(fā)生的獨立影響因素(P<0.05)，見表4。

表4 多因素Logistic 回歸分析術后下肢DVT 發(fā)生的影響因素

2.5 ROC 分析血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平對術后下肢DVT 發(fā)生的預測價值 以DVT 組32例為陽性樣本，以非DVT 組76 例為陰性樣本，ROC分析顯示術后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平聯(lián)合預測術后下肢DVT 發(fā)生的AUC 大于單項指標預測(P<0.05)，見表5。

表5 ROC 分析血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平對術后下肢DVT 發(fā)生的預測價值

3 討論

膝關節(jié)置換術后下肢DVT 生成可能與炎性反應、血管內皮細胞炎性損傷、血管內壁損傷、血液高凝狀態(tài)等有關，膝關節(jié)置換術中機體可激活凝血系統(tǒng)，增加凝血酶含量，血液呈高凝狀態(tài)，術后長時間臥床導致下肢靜脈回流受限，可增加DVT 生成風險[8]。

血小板可促進NETs 產生，NETs 可直接與FⅫ結合，將其轉化為活化的凝血因子，激活內源性凝血途徑，促使天然抗凝物質降解失活，誘導血小板聚集，參與靜脈血栓形成過程[9]。本研究結果顯示，DVT 組血清NETs 水平高于非DVT 組，與Caprini 評分呈正相關，提示NETs 水平升高與術后下肢DVT 生成密切相關。術中刺激中性粒細胞可釋放線粒體DNA，增加NETs 生成量，而下肢血流速度減慢，可引起血液淤積，也可參與NETs 形成，同時NETs 與血小板活化、凝血瀑布反應激活有關，引起血液高凝狀態(tài)，促進血栓形成，這些過程表明NETs 是DVT 生成的重要因子之一。陳塍林等[10]研究表明術后血清NETs 水平升高可能為膝關節(jié)置換術后下肢DVT 生成的影響因素，術后3 d 血清NETs 水平預測術后下肢DVT 生成的AUC 為0.831。本研究發(fā)現(xiàn)術后3 d 血清NETs 水平預測術后下肢DVT 生成的AUC 為0.778，分析原因可能與樣本量不同有關。FIB 是由肝臟合成的血漿糖蛋白，屬于纖維蛋白被纖溶酶裂解的特異性分子標志物，其水平與DVT 生成密切相關，機體凝血活性增強，F(xiàn)IB 水平升高可反映繼發(fā)性纖溶亢進、高凝狀態(tài)，抑制機體纖溶過程[11]。本研究結果顯示，DVT 組血清FIB 水平高于非DVT 組，與陳瀟等[12]研究報道結果相似。同時本研究發(fā)現(xiàn)FIB 水平與Caprini 評分呈正相關，其水平升高為術后下肢DVT 發(fā)生的危險因素，提示FIB 水平升高可能參與術后下肢DVT 發(fā)生過程。分析原因可能為膝關節(jié)置換術后破損微小軟組織可通過血管進入血液循環(huán)系統(tǒng)，激活凝血機制，促使炎性介質釋放入血液，而凝血機制亢進可引起DVT，手術操作可加重應激反應，術后肢體活動減少可降低血液流速，加重DVT 程度，血管損傷后FIB 轉化為纖維蛋白，可激活凝血因子，加速血液凝固，參與DVT 形成過程。

miRNA 可通過靶向結合下游靶基因，參與調控細胞增殖、分化等過程，其表達異常與類風濕性關節(jié)炎等多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關，miR-374a-5p 可抑制白細胞介素-10(IL-10)表達，導致機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，引起血管內皮細胞炎性損傷，最終導致DVT 形成，但僅從動物實驗、細胞實驗初步證實miR-374a-5p 可能為DVT 治療有效靶點[13]。本研究發(fā)現(xiàn)DVT 組血清miR-374a-5p 水平高于非DVT 組，且與DVT 發(fā)生密切相關。已知miR-374a-5p 可通過與IL-10 結合，引起血管內皮炎性損傷，并可參與血栓形成、冠脈復流等發(fā)生過程[14-15]，由此推測miR-374a-5p 水平升高可抑制IL-10 表達，調控炎性因子表達水平，加劇患肢炎性反應，影響靜脈血栓溶解再通過程，導致術后下肢DVT 生成。同時本研究還發(fā)現(xiàn)術后3 d 血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平聯(lián)合預測術后下肢DVT 發(fā)生的AUC 大于單項指標預測，可為臨床預防DVT 提供循證支持。

綜上所述，膝關節(jié)置換術后下肢DVT 生成者血清NETs、FIB、miR-374a-5p 水平升高，且與DVT形成密切相關，聯(lián)合檢測其水平可預測術后下肢DVT 生成風險，可為防治DVT 提供新思路。