陳志華，王勤章，丁國富，錢 彪，李 強，倪 釗

（石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆石河子 832000）

腎透明細胞癌是腎臟最常見的惡性腫瘤，約10%～25%的患者可能會發(fā)生腎門和局部淋巴結轉移，淋巴結出現轉移表明患者的預后不良［1］。多年來由于缺乏淋巴管內皮細胞的特異標記物，對于淋巴管的研究相對較少，也未引起足夠的重視。近年來，由于D2－40能特異地標記淋巴管而被學者作為一免疫組織化學物應用于標記腫瘤淋巴管新生［2］。目前腎透明細胞癌淋巴管新生對患者預后的影響還不清楚，本研究旨在利用D2－40來標記淋巴管，探討腎透明細胞癌淋巴管新生與臨床病理因素的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象是在石河子大學第一附屬醫(yī)院病理科收集的2005～2012年被診斷為腎透明細胞癌的60例患者的石蠟塊。納入標準：調閱蠟塊的HE切片包含癌組織和正常腎組織。26 例女性，34例男性，患者年齡35～71 歲，平均（58.21±11.34）歲。所有患者均行根治性腎切除術或腎部分切除術，其中15例患者因懷疑淋巴結轉移，術中行淋巴結清掃，其余45例患者沒有行淋巴結清掃。臨床病理因素包括遠處轉移、淋巴結轉移、T 分期及Furman細胞核分級從患者病例資料和術后病理檢查結果獲得。

1.2 染色方法 采用SP 法進行免疫組織化學染色，單克隆抗體D2－40（ZM－0465）和二抗試劑盒均購至北京中衫金橋生物技術有限公司。將石蠟塊4μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，乙醇水化。用3% 的過氧化氫浸泡10min來阻斷內源性過氧化物酶活性，然后將玻片放入0.01mol／L、pH6.0的檸檬酸緩沖液中，置入高壓鍋中加熱至噴氣后開始計時，8min后停止加熱以充分暴露抗原。滴加鼠抗人D2－40抗體，4℃孵育過夜，加入第二抗體，37℃恒溫箱反應30 min。隨后用二胺基聯苯胺四鹽酸鹽在顯微鏡下觀察顯色，顯色時間依觀察結果靈活掌握調控。再經蘇木精對比染色，脫水、透明、封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性結果作陽性對照。處理完成后用光學顯微鏡來觀察。

1.3 結果判定 所有的標本均由兩位有經驗的病理科醫(yī)師進行雙盲法閱片。免疫組化切片中見D2－40標記的條索狀、管腔樣結構的細胞胞質或胞膜內出現棕黃色標記物為陽性，一個管腔切面或一條條索狀物計數為一條新生淋巴管。腫瘤組織外500μm 區(qū)域被認為是癌周組織區(qū)域。首先在10×10倍鏡視野確定每張組織切片內陽性染色脈管最豐富區(qū)，再在10×20倍視野下隨機取3個視野計數淋巴管數目，統(tǒng)計每個視野中的淋巴管數目，然后取3個視野平均值作為癌周淋巴管密度。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0版軟件進行統(tǒng)計分析。淋巴管新生與臨床病理因素的相關性，用χ2檢驗或Fisher's確切概率法進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

60例研究對象均為腎透明細胞癌。按Fuhrman細胞核分級標準進行分級，其中Ⅰ級4 例，Ⅱ級38例，Ⅲ級17例，Ⅳ級1例。按2011年的腎腫瘤TNM分期標準進行分期，36例 為pT1，7 例 為pT2，15 例為pT3，2例為pT4。6例發(fā)生遠處轉移，行淋巴結清掃的患者有5例出現淋巴結轉移。

2.1 D2－40在腎透明細胞癌中的表達情況 通過顯微鏡觀察發(fā)現癌旁正常腎組織內在血管周圍有少量的淋巴管；癌周區(qū)淋巴管豐富，擴張與閉鎖的淋巴管共存，以擴張的淋巴管為主；在癌內區(qū)，淋巴管的數量明顯減少甚至缺如，故僅觀察癌內是否有淋巴管出現（圖1）。

圖1 D2－40在腎透明細胞癌組織（DAB，×200）

2.2 D2－40在腎透明細胞癌中的表達與臨床病理因素的關系 所有研究對象均觀察到豐富的癌周淋巴管（peritumoral lymphatic vessels，PLVs），13例觀察到有癌內淋巴管（intratumoral lymphatic vessels，ILVs）出現。平均的癌周淋巴管密度（peritumoral lymphatic vessels density，PLVD）是16.89，29例患者的PLVD≥16.89，31例患者的PLVD＜16.89，兩組在遠處轉移、淋巴結轉移、Fuhrman細胞核分級及腫瘤T 分期間的比較結果均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

按癌內是否有淋巴管出現分為陽性表達組（ILV－positive）和陰性表達組（ILV－negative），兩組間在遠處轉移，淋巴結轉移，Fuhrman細胞核分級的比較結果有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對于腫瘤T 分期則無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

表1 PLVD與臨床病理因素間的相關性 （例）

表2 ILVs的出現與臨床病理因素間的相關性

3 討論

腎透明細胞癌是腎臟最常見的癌癥，有很多的臨床病理因素對患者的預后有影響，包括遠處轉移、淋巴結轉移、腫瘤分期、Fuhrman細胞核分級及血管侵犯等。目前已有大量的學者在進行腎腫瘤血管方面的研究，對于淋巴管方面的研究相對較少，這一現狀直到淋巴內皮細胞D2－40的出現才得到改善。D2－40分子是MARKS等［3］于1999年在研究生殖細胞腫瘤和胚胎睪丸的精母細胞表面時新發(fā)現的一種唾液酸黏蛋白。SAAD等［4］的研究發(fā)現D2－40能特異性地標記淋巴管內皮細胞，而不標記毛細血管，更不標記血管內皮，被視為最佳的淋巴管標記物，被越來越多應用于區(qū)別血管和淋巴管。一些研究已經在利用D2－40采用免疫組織化學的方法來評價淋巴管新生與臨床病理因素之間的關系。

在我們的研究中，60例腎透明細胞癌患者的標本均發(fā)現有豐富的PLV，平均PLVD 為16.89，我們經統(tǒng)計學分析發(fā)現PLVD 與臨床病理因素均無相關性，表明癌周淋巴管新生對患者的預后可能無影響。這一結果與IWATA T等［5］的研究相似，他們發(fā)現在腎細胞癌中，癌周淋巴管數與臨床病理因素無明顯的相關性，認為癌周淋巴管對于腫瘤的進展起次要的作用。ISHIKAWA等［6］的研究 通過應 用D2－40 進 行免疫組化染色能清楚顯示正常和病理狀態(tài)下腎組織的淋巴管分布，他們的研究結果也表明腎細胞癌PLV 的數量較正常的腎皮質明顯的增加，但沒有發(fā)現PLVD 與淋巴結轉移有相關性，BALDEWIJNS等［7］的研究則表明癌周淋巴管新生與腫瘤TNM 分期及Fuhrman細胞核分級無關系，認為癌周與正常的腎組織淋巴管數量無差異。而丁貴坡等［8］發(fā)現在乳腺癌中PLVD 與腫瘤的大小、臨床分期及淋巴結轉移狀態(tài)相關。ZENG等［9］發(fā)現在前列腺癌中，癌周淋巴管密度和癌周淋巴管侵犯與腫瘤淋巴管轉移有顯著的相關性。間接表明癌周淋巴管新生對患者的預后有不良影響，與我們的結果相悖。本研究僅有13例患者的標本發(fā)現ILV，淋巴管數較少，大部分呈長條形或塌陷狀態(tài)，考慮為癌組織間高壓所致。統(tǒng)計學分析表明遠處轉移、淋巴管轉移及Fuhrman細胞核分級均與ILV 的出現有顯著的相關性。ILYAS等［10］的研究結果與我們相似，他們同樣沒有發(fā)現PLVD與臨床病理因素有相關性，ILVs與遠處轉移和淋巴管轉移有顯著相關性。PAWEL DE BIńSKI等［11］也發(fā)現癌內淋巴管的出現與臨床病理因素有顯著相關性。遠處轉移和淋巴管轉移及Fuhrman細胞核分級已被證實與腫瘤患者預后密切相關，說明癌內淋巴管新生在腫瘤的進展中起重要的作用，故我們有理由相信癌內淋巴管新生對患者的預后可能有不良影響。至于癌內淋巴管新生如何對患者的預后造成影響，其原因尚不明確。相關研究提示多種惡性腫瘤組織中存在新生淋巴管，但癌細胞是通過已有的淋巴管還是新生的淋巴管轉移存在很大爭議［12］。傳統(tǒng)觀點認為腫瘤的淋巴道轉移是一個被動過程，腫瘤細胞通過已有的局部淋巴管轉移到區(qū)域淋巴結，其中淋巴管內皮細胞只是起到被動作用。在本研究中，僅少數患者有ILV 出現且與淋巴結轉移密切相關（P＝0.017），故我們考慮癌內新生的淋巴管可能促進了淋巴結的轉移。具體的機制還需要大量相關研究來探討。

綜上所述，我們認為癌內淋巴管新生可能對腎透明細胞癌患者的預后有不良影響，可以作為判斷患者術后預后不良的因素，對術后患者預后的預測及輔助治療擴展思路，提供臨床應用價值。但還需要大樣本研究來進一步證實，因為這一類的相關研究較少，且他們的研究結果往往相矛盾。下一步我們將對患者預后資料進行收集和分析來進一步論證腎透明細胞癌淋巴管新生對患者預后的影響。

［1］TERRONE C，CRACCO C，PORPIGLIA F，et al.Reassessing the current TNM lymph node staging for renal cell carcinoma［J］.Eur Urol，2006，49（2）：324－331.

［2］ANDREE C，SCHMIDT VJ，MUNDER BIJ，et al.Detecting of breast cancer metastasis by means of regional lymph node sampling during autologous breast reconstruction－a screening of 519 consecutive patients［J］.Med Sci Monit，2012，18（10）：605－610.

［3］MARKS A，SUTHERLAND DR，BAILEY D，et al.Characterization and distribution of an oncofetal antigen（M2Aantigen）expressed on testicular germ cell tumours［J］.Br J Cancer，1999，80（4）：569－578.

［4］SAAD RS，KORDUNSKY L，LIU YL，et al.Lymphatic miemvessel density as prognostic marker in eolorectal cancer［J］.Mod Pathol，2006，19（10）：1317－1323.

［5］IWATA T，MIYATA Y，KANDA S，et al.Lymphangiogenesis and angiogenesis in conventional renal cell carcinoma－association with vascular endothelial growth factors A to D immunohistochemistry［J］.Urology，2008，71（4）：749－54.

［6］ISHIKAWA Y，AIDA S，TAMAI S，et al.Significance of lymphatic invasion and proliferation on regional lymph node metastasis in renal cell carcinoma［J］.Am J Clin Pathol，2007，128（2）：198－207.

［7］BALDEWIJNS MM，ROSKAMS T，BALLET V，et al.A low frequency of lymph node metastasis in clear－cell renal carcinoma is related to low lymphangiogenic activity［J］.BJU Int，2009，103（12）：1626－1631.

［8］丁貴坡，葉長生.D2－40 標記人乳腺癌淋巴管密度的臨床病理意義［J］.實用醫(yī)學雜志，2009，25（18）：3051－3053.

［9］ZENG Y，OPESKIN K，HORVATH LG，et al.Lymphatic vessel density and lymph node metastasis in prostate cancer［J］.Prostate，2005，65（3）：222－230.

［10］ILYAS OZARDILI，MEHMET EMIN GULDUR1，HALIL CIFTCI，et al.Correlation between lymphangiogenesis and clinicopathological parameters in renal cell carcinoma［J］.Singapore Med J，2012，53（5）：332－335.

［11］PAWEL DE BIńSKI，JANUSZ DEMBOWSKI，PAWEL KOWAL，et al.The clinical significance of lymphangiogenesis in renal cell carcinoma［J］.Med Sci Monit，2013，19（1）：606－611.

［12］DA MX，WU XT，WANG J，et al.Expression of cyclooxygenase－2and vascular endothelial growth factor－C correlates with lymphangiogenesis and lymphatic invasion in human gastric cancer［J］.Arch Med Res，2008，39（1）：92－99.