張軍衛(wèi)，靳風(fēng)爍，龔晉遷，彭東濤，王 剛

（1.重慶市第九人民醫(yī)院泌尿外科，重慶 400700；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科，重慶 400042）

膀胱腫瘤是泌尿系最常見的惡性腫瘤，以非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌為主，其主要特點(diǎn)為復(fù)發(fā)率高。近來國(guó)內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)資料表明結(jié)直腸癌、前列腺癌和膀胱癌等多種人類腫瘤COX－2（環(huán)氧化酶－2）的表達(dá)明顯增高，使用COX－2抑制劑可使腫瘤增殖抑制，但是其機(jī)制目前尚不清楚。本研究探討環(huán)氧化酶－2反義核酸對(duì)膀胱癌細(xì)胞株裸鼠成瘤的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌株及質(zhì)粒 人膀胱癌T24細(xì)胞株由本室凍存；含hCOX－2 全長(zhǎng)cDNA 質(zhì)粒pCB7，由美國(guó)大學(xué)Dubinett教授饋贈(zèng)；pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒、pMD18－T Vector購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 人環(huán)氧化酶－2 反義核酸真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建并鑒定。

1.1.3 裸鼠 6～8周齡BALB／c nu／nu裸鼠，均為雄性，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，本院動(dòng)物室飼養(yǎng)。

1.1.4 主要試劑 脂質(zhì)體lipofectAMINE 2000購(gòu)自美國(guó)Roche 公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone，鼠抗人COX－2單克隆抗體購(gòu)自 北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染 應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法獲得了穩(wěn)定表達(dá)人環(huán)氧化酶－2反義核酸的膀胱癌細(xì)胞，并用抗生素篩選保證其穩(wěn)定的表達(dá)，再通過免疫細(xì)胞化學(xué)與RT－PCR驗(yàn)證其COX－2蛋白及mRNA水平下調(diào)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞株 T24、T24－AS、T24－P培養(yǎng)于含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2（體積分?jǐn)?shù)）飽和濕度的條件下生長(zhǎng)、傳代。

1.2.3 裸鼠成瘤性實(shí)驗(yàn) 分為3組（T24、T24－AS、T24－P），每組9只裸鼠。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液（2.5×107／mL），抽取0.2mL接種于裸鼠背部皮下，接種后于無特殊病原菌（SPF）條件下飼養(yǎng)。從接種之日起，每隔7d測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的長(zhǎng)度（L）和寬度（W）。腫瘤體積計(jì)算公式為：V＝0.5236×L×W2。30d后處死裸鼠，取瘤塊稱重、測(cè)量腫瘤體積后，取少量組織塊在10%（體積分?jǐn)?shù)）中性甲醛中固定，梯度乙醇脫水，最后用石蠟包埋。

1.3 研究方法與觀察指標(biāo) 免疫組化、半定量RTPCR、Wester blot檢測(cè)移植瘤COX－2 表達(dá)，光鏡和電鏡觀察移植瘤形態(tài)學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取，顯著性檢驗(yàn)用SPASS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni法，假設(shè)檢驗(yàn)的顯著性水準(zhǔn)取α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠移植瘤重量及體積測(cè)定 對(duì)照組T24、T24－P組細(xì)胞接種裸鼠后第5天可見腫瘤長(zhǎng)出，反義核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞T24－AS接種后第9天可見腫瘤長(zhǎng)出。接種后第9天開始測(cè)量瘤體大小，以后每7d測(cè)量一次，共測(cè)量瘤體體積4次。30d后處死，剝離瘤體稱重，3組裸鼠移植瘤平均重量、體積經(jīng)方差分析表明，T24－AS成瘤性顯著低于未T24、T24－P組，差異有顯著性意義（P＜0.01），而T24與T24－P組裸鼠移植瘤間差異無顯著性意義（P＞0.05），見表1。

表1 COX－2表達(dá)對(duì)T24膀胱癌裸鼠移植瘤重量和體積的影響 （）

表1 COX－2表達(dá)對(duì)T24膀胱癌裸鼠移植瘤重量和體積的影響 （）

＊與T24－P組比較，P＞0.05；△與T24和T24－P組比較，P＜0.01。

2.2 3 組裸鼠移植瘤的免疫組化染色結(jié)果比較T24、T24－P組免疫組化染色顯示移植瘤細(xì)胞胞質(zhì)和核膜呈深棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多，而T24－AS組僅少量細(xì)胞呈淡黃色染色。見圖1。

圖1 3組裸鼠移植瘤免疫組化染色（倒置顯微鏡，×200）

2.3 RT－PCR與Western blot檢測(cè)結(jié)果 T24、T24－P組均顯示COX－2表達(dá)明顯，而T24－AS組均少量表達(dá)，見圖2、圖3。

圖2 移植瘤COX－2表達(dá)RT－PCR檢測(cè)

圖3 移植瘤COX－2表達(dá)Western blot檢測(cè)

2.4 裸鼠移植瘤病理結(jié)果 荷瘤鼠解剖后肉眼觀移植瘤均呈圓形或橢圓形，表面有結(jié)節(jié)狀突起，瘤外有不完整的包膜，質(zhì)中等、切面呈實(shí)性、灰白色，中心有些有出血、壞死，T24組可見部分腫瘤侵犯肌肉及皮膚。

2.4.1 光鏡檢查 T24、T24－P 組見腫瘤細(xì)胞大小不一、異型性明顯，壞死區(qū)均一粉染，癌細(xì)胞呈圓形、橢圓形、多角形或梭形，胞核大，核漿比例大，有的胞質(zhì)較空亮，病理性核分裂相多見，癌細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)。而T24－AS組腫瘤表現(xiàn)類似，但凋亡細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞固縮、胞質(zhì)濃縮、核濃縮成塊狀、深染集中于核膜下，細(xì)胞間連接松解，細(xì)胞離散，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞間可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有的細(xì)胞崩解成碎片，見圖4。

圖4 3組裸鼠移植瘤光鏡下結(jié)果（HE，×400）

2.4.2 透視電鏡檢查 T24、T24－P 組細(xì)胞見癌細(xì)胞大小及形態(tài)各異排列不規(guī)則，癌細(xì)胞呈圓形、橢圓形和不規(guī)則形，常染色質(zhì)增多，常見雙核、多核。瘤細(xì)胞表面非對(duì)稱單位膜結(jié)構(gòu)喪失，胞質(zhì)較少、梭形小泡消失，線粒體常見不同程度空泡化，可見大量游離核糖體、糖原顆粒，張力微絲增多，細(xì)胞間松散。T24－AS組可見凋亡小體出現(xiàn)，凋亡細(xì)胞增多，凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜完整，胞體皺縮形成突起，胞質(zhì)濃縮核仁消失，異染色質(zhì)邊集，碎裂成團(tuán)塊狀沿核膜分布，見圖5。

圖5 3組裸鼠移植瘤透視電鏡下結(jié)果（TEM，×5 000）

3 討論

膀胱腫瘤居全身惡性腫瘤發(fā)病率的第9位，是我國(guó)泌尿系最常見的惡性腫瘤，2008年統(tǒng)計(jì)膀胱癌死亡率為2.63／105，占中國(guó)惡性腫瘤死亡構(gòu)成的1.42%，膀胱癌以非肌層浸潤(rùn)性生長(zhǎng)為主，術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)30%～85%，目前化療的有效率僅為15%～20%［1－2］。2012年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)報(bào)告示新發(fā)的膀胱癌有73 510 例，而死于膀胱癌達(dá)14 880 例［3］。近20年來膀胱癌的診斷方法、治療手段以及對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究有很大進(jìn)展，而遺憾地是其預(yù)后沒有明顯的改善。

近年來國(guó)內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)資料表明結(jié)直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌和膀胱癌等多種人類腫瘤COX－2的表達(dá)明顯增高，使用COX－2抑制劑可抑制腫瘤增殖，表明COX－2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［4］。COX 具有兩個(gè)亞型，COX－1在多種組織中均有表達(dá)，與組織自身穩(wěn)定有關(guān)；COX－2在多數(shù)組織中正常生理情況下無明顯表達(dá)，但當(dāng)受到一些細(xì)胞因子或有絲分裂原誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)增高，與炎癥、腫瘤等病理過程有關(guān)［5－6］。

在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染獲得了穩(wěn)定表達(dá)人環(huán)氧化酶－2反義核酸的膀胱癌細(xì)胞，并通過免疫細(xì)胞化學(xué)與RT－PCR證實(shí)其COX－2蛋白及mRNA 水平顯著下降，表明轉(zhuǎn)染是成功的，并且得到穩(wěn)定表達(dá)。但基因的封閉往往不能達(dá)到百分之百，尚有部分COX－2的表達(dá)，這為研究COX－2表達(dá)差異對(duì)裸鼠成瘤性的影響提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。經(jīng)過RT－PCR 和Western blot及免疫組化染色均證實(shí)反義COX－2核酸轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞所建立的移植瘤T24組的COX－2表達(dá)較未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的移植瘤T24和T24－P組明顯減少，而實(shí)驗(yàn)中COX－2表達(dá)與裸鼠移植瘤的形成呈正相關(guān)，說明通過抑制其表達(dá)可成為抗腫瘤的新途徑，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7－9］。

NSAIDs（非甾體類抗炎藥）為一類不含類固醇的甾體結(jié)構(gòu)而具抗炎、止痛和解熱作用的藥物，70年代以來得到了迅速發(fā)展。目前大量研究表明COX－2選擇性抑制比傳統(tǒng)的NSAIDs更為安全有效，有較佳的胃腸耐受性而抗炎活性相當(dāng)，目前已上市的有塞來昔布、尼美舒利、美洛昔康、NS－398等。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示塞來昔布是結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌發(fā)生的保護(hù)因素，研究者發(fā)現(xiàn)塞來昔布400mg每日兩次，連用6個(gè)月可顯著降低FAP 患者的結(jié)直腸息肉數(shù)目。選擇性COX－2抑制劑對(duì)其他腫瘤的預(yù)防和治療作用也有報(bào)道。Barrett's食管是癌前病變，目前尚無確切的證據(jù)證明藥物或外科手術(shù)能使其逆轉(zhuǎn)，聯(lián)合應(yīng)用抑酸劑和選擇性COX－2抑制劑可能是最有效的化學(xué)預(yù)防策略。

近年研究表明COX－2有可能通過其合成的PGs促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管形成以及使局部免疫抑制等參與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等多種惡性行為，參與腫瘤發(fā)展過程中的相關(guān)分子機(jī)制，P53基因或ras基因突變的細(xì)胞COX－2表答也增強(qiáng)，它們之間可能存在協(xié)同作用［10－11］。以COX－2為靶點(diǎn)抑制腫瘤的機(jī)制尚不清楚，其抗腫瘤作用途徑可能是多方面的，可能與阻斷前列腺素的合成，起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移的作用有關(guān)，或者是通過不同途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡［12－13］。COX－2抑制劑除了可以抑制COX－2 以上作用外，還可以產(chǎn)生一些不依賴于COX－2的作用。最近有報(bào)道應(yīng)用塞來昔布輔助化療治療膀胱癌，但樣本數(shù)量有限，未來大宗的前瞻性的研究可能會(huì)給臨床應(yīng)用提供有力的證據(jù)［14－15］。

本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)COX－2在膀胱腫瘤形成中的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討，COX－2 基因阻斷治療體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤特性，支持了COX－2與腫瘤密切相關(guān)，盡管走向臨床應(yīng)用還需要過更多的研究，但無疑這些努力將會(huì)對(duì)膀胱癌的治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

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