李冠喜，吳小芹，葉建仁

(1.南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037;2.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222006;3.江蘇省入侵有害生物預(yù)防與控制重點實驗室，江蘇 南京 210037)

在土壤磷庫中，有機(jī)磷的含量占全磷的比例約為15%～80%［1-2］，我國大部分土壤中有機(jī)磷占全磷的比重為20%～50%［3］。土壤中有機(jī)磷主要有磷酸肌醇、磷酯和核酸、少量的磷蛋白和磷酸糖以及微生物量磷，其中肌醇磷酸鹽含量最高，占有機(jī)磷總量的一半左右［4］。微生物分泌的磷酸酶是土壤中有機(jī)磷降解酶的主要來源，在磷酸酶的作用下，有機(jī)磷大分子變?yōu)樾》肿拥臒o機(jī)磷，從而植物可以直接吸收和利用。因此，土壤中的有機(jī)磷是植物可利用磷的重要來源［5］。

磷酸酶是一個系統(tǒng)名稱，代表一組可催化磷酸酯或磷酸酐水解的酶。國際生物化學(xué)聯(lián)合會酶學(xué)委員會將這些酶劃分為5 大類，分別為磷酸單酯水解酶，磷酸二酯水解酶，二磷酸單酯水解酶，作用于含磷酸酐的酶和作用于P-N 鍵的酶。其中研究最為深入的是酸性磷酸單酯水解酶(簡稱為酸性磷酸酶，ACP)和堿性磷酸單酯水解酶(簡稱為堿性磷酸酶，AKP)，前者分布于酸性土壤中而后者在堿性土壤中占優(yōu)勢［6］，本研究主要探討了多噬伯克霍爾德氏菌Burkholderia multivorans WS-FJ9 所分泌的ACP 和AKP 在胞外胞內(nèi)的定域表達(dá)及其降解有機(jī)磷的最佳條件。WS-FJ9 為本實驗室在前期研究中從松樹根際篩選獲得的一株高效解磷細(xì)菌，前期的研究表明，該菌對哺乳動物和植物安全可靠，能夠在楊樹根際穩(wěn)定定殖，具有促進(jìn)植物生長、生物防治和生物降解等功能［7-9］。本研究旨在探索該菌株的酶促反應(yīng)條件，并為解磷酶制劑及生物菌肥的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為多噬伯克霍爾德氏菌Burkholderia multivorans WS-FJ9，由本實驗室分離篩選所得，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC(NO.CCTCC M2011435)［10］。

1.2 供試培養(yǎng)基

蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖l0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCL 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，Mn-SO4·4H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCO35 g，卵磷脂0.2 g，水1 000 mL，pH 調(diào)節(jié)至7.2～7.4。

1.3 磷酸酶活性的測定

1.3.1 試劑的配制 (1)改進(jìn)的通用緩沖試劑(modified universal buffer，MUB)儲備液的配制。取12.1 g三羥甲基氨基甲烷、11.6 g 順丁烯二酸，14.0 g 檸檬酸和6.3 g 硼酸溶于488 mL 氫氧化鈉溶液(1 mol/L)中，再用蒸餾水稀釋至1 L，儲存于冰箱中。

(2)通用緩沖試劑(MUB)(pH 為6.5 和11)的配制。取200 mL MUB 儲備液用0.l mol/L 的鹽酸滴定至pH 6.5，再用蒸餾水定容至1 L;另取200 mL MUB 儲備液用0.l mol/L 的氫氧化鈉滴定至pH 11，再用蒸餾水定容至1 L。

(3)對硝基苯磷酸二鈉溶液的配制。取0.630 g 對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)溶于40 mL MUB(pH 為6.5 的用于檢測酸性磷酸酶，pH 為11 時用于檢測堿性磷酸酶)中，再用相同pH 的MUB 分別將溶液定容至50 mL(濃度為0.025 mol/L)并儲存于冰箱中，24 h 內(nèi)現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 磷酸酶活性測定 參照鐘傳青［11］的方法，取l mL 細(xì)胞提取液于干凈試管中，加入4 mL MUB(檢測酸性磷酸酶時用pH 6.5 的MUB，檢測堿性磷酸酶時用pH 11 的MUB)，再加入用相同緩沖液配制成的0.025 mol/L 對硝基苯磷酸二鈉溶液1 mL 后震蕩幾秒鐘，塞住瓶塞于37 ℃水浴1 h，打開瓶塞，加入0.5 mol/L 的氯化鈣1 mL 和0.5 mol/L 的氫氧化鈉4 mL 并震蕩混勻，離心(4 ℃，7 000 r/min)5 min后，上清液于420 nm 處比色。酶活力單位定義為以1 min 內(nèi)1 L 發(fā)酵液中作用于底物產(chǎn)生硝基苯酚的微摩爾數(shù)，記為μmol/(L·min)。

1.4 WS-FJ9 細(xì)胞提取液的制備與磷酸酶定域的測定

參照戴樹桂等［12］和陳丹［13］的方法，先取菌液離心(6 000 r/min，10 min)，上清液(S1)凍存;沉淀(P1)用10 mL(pH 8.0)10 mmol/L Tris-HCl 重懸，離心(6 000 r/min，10 min)，洗滌2 次，上清液(S2)凍存;沉淀(P2)以10 mL 25%蔗糖溶液重懸，于25C 振蕩10 min，離心(6 000 r/min，10 min)，上清液(S3)凍存;沉淀(P3)加冷雙蒸水重懸，在冰浴中振蕩10 min，離心(6 000 r/min，10 min)，上清液(S4)凍存;沉淀(P4)用10 mL(pH 8.0)50 mmol/L Tris-HCl 重懸，冰浴中超聲破碎細(xì)胞(間隔3 s，共破碎4 min)，離心(10 000 r/min)10 min 后，上清液(S5)凍存，沉淀(P5)棄去。將S1、S2、S3 合并，即為胞外提取液，S4 為膜周質(zhì)提取液，S5 為膜內(nèi)提取液。采用1.3.2 的方法分別測定各類提取液酸、堿性磷酸酶活性，判斷磷酸酶在細(xì)胞內(nèi)的具體定位。

1.5 不同營養(yǎng)條件下磷酸酶活性和解磷量的測定

先固定氮源為蛋白胨、磷源為卵磷脂，篩選出最佳碳源;再固定碳源為篩選出的最佳碳源、磷源為卵磷脂，篩選出最佳氮源;最后固定碳、氮源為篩選出的最佳碳、氮源，篩選出最佳磷源。將蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源分別改為蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和甘露醇，氮源分別改為蛋白胨、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈣，磷源分別改為植酸鈣、草甘膦、Ca3(PO4)2進(jìn)行營養(yǎng)條件優(yōu)化;調(diào)節(jié)蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基卵磷脂加入量0.1、0.3、0.5、0.7 和0.9 g 測定卵磷脂濃度對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性及解磷能力的影響;所有處理均采用相同體積培養(yǎng)液(50 mL)接種相同體積的種子液(500 μL)并設(shè)置3 次重復(fù)，以接種相同體積空白種子液的解磷培養(yǎng)基為對照(CK)，28 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h 后，發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，加入0.5 g 無磷活性炭，采用SM-650D 型超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎20 min 后離心(4 ℃，10 000 r/min)10 min，分別取上清液測定磷酸酶活性和可溶性磷含量?？扇苄粤缀康臏y定采用鉬銻抗比色法(張祥勝，2008)。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Origin 8.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、差異顯著性檢驗(P＜0.05)及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9 磷酸酶的細(xì)胞定位

WS-FJ9 菌株磷酸酶定域如圖1 所示。圖1 表明，菌株WS-FJ9 既可以產(chǎn)生酸性磷酸酶也能產(chǎn)生堿性磷酸酶，且2 種酶在細(xì)胞內(nèi)、胞外細(xì)胞膜中均有存在。其中以細(xì)胞外分布為最高，酶活分別為71.8 μmol/(L·min)和22.8 μmol/(L·min);細(xì)胞內(nèi)次之，酸性磷酸酶和堿性磷酸酶分別為32.1 μmol/(L·min)和8.5 μmol/(L·min);細(xì)胞膜周的酶活性最低。據(jù)此認(rèn)定該菌株的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均主要定位于細(xì)胞外，即主要是通過分泌到胞外對有機(jī)磷進(jìn)行分解。研究還發(fā)現(xiàn)無論是胞內(nèi)、胞外還是膜周，酸性磷酸酶的含量都高于堿性磷酸酶，尤其在胞外酸性磷酸酶占絕對優(yōu)勢，由此判斷該菌以分泌酸性磷酸酶為主。因此后續(xù)試驗僅測定酸性磷酸酶活性。

圖1 多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9 菌株磷酸酶的細(xì)胞定位Fig.1 Phosphatase cellular localization of strain B.multivorans WS-FJ9

2.2 碳源對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性及解有機(jī)磷能力的影響

不同碳源對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性及解磷能力的影響差異顯著(P＜0.05)，從圖2 可知，當(dāng)以葡萄糖為碳源時，磷酸酶活性和解磷量均為最高，分別為240 μmol/(L·min)和430.5 mg/L;果糖的效果最差，僅分別為70.3 μmol/(L·min)和102.8 mg/L。因此判定在供試碳源中，葡萄糖為多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9 分解有機(jī)磷能力發(fā)揮的最適碳源。

2.3 氮源對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性及解有機(jī)磷能力的影響

從圖3 中看出，不同的氮源對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性和解磷能力影響差異顯著(P＜0.05)。以硫酸銨為氮源時，該菌株的磷酸酶活性及解磷能力最強(qiáng)，分別達(dá)到247.5 μmol/(L·min)和448.8 mg/L，而其他氮源的應(yīng)用效果顯著低于硫酸銨，尤其是以尿素為氮源時，該菌株的磷酸酶活性及解磷能力最低，僅為68.3 μmol/(L·min)和98.6 mg/L。因此硫酸銨為WS-FJ9 菌株解有機(jī)磷能力發(fā)揮的最適氮源。

圖2 不同碳源對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性和解磷能力的影響Fig.2 Effect of different carbon source on the phosphatase activity and P-dissolving ability of strain WS-FJ9

圖3 不同氮源對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性和解磷能力的影響Fig.3 Effect of different nitrogen source on the phosphatase activity and P-dissolving ability of strain WS-FJ9

2.4 磷源對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性及解磷能力的影響

由圖4 可知，不同磷源對WS-FJ9 磷酸酶活性及解磷能力的影響差異顯著(P＜0.05);以卵磷脂為磷源時，磷酸酶活性最高(為239.5 μmol/(L·min))但解磷量(為432.3 mg/L)低于Ca3(PO4)2而高于植酸鈣和草甘膦;以Ca3(PO4)2為磷源時，磷酸酶活性最低［僅為48.5 μmol/(L·min)］但解磷量最高(為479.6 mg/L)，推測WS-FJ9 菌株是通過磷酸酶以外的其他途徑降解無機(jī)磷酸鹽［Ca3(PO4)2］的;以草甘膦為磷源時，磷酸酶活性和解磷量分別為105.6 μmol/(L·min)和97.2 mg/L。因此卵磷脂為WSFJ9 菌株解有機(jī)磷能力發(fā)揮的最理想磷源。同時本實驗發(fā)現(xiàn)該菌能對草甘膦進(jìn)行有效降解，這對草甘膦農(nóng)藥殘留的治理具有重要意義。

圖4 不同磷源對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性和解磷能力的影響Fig.4 Effect of different phosphorus source on phosphatase activity and P-dissolving ability

圖5 卵磷脂濃度對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性及解磷能力的影響Fig.5 Effect of different lecithin concentration on the phosphatase activity and P-dissolving ability of strain WS-FJ9

2.5 卵磷脂濃度對WS-FJ9 菌株磷酸酶活性及解磷能力的影響

WS-FJ9 菌株分泌的磷酸酶活性及解磷能力均受培養(yǎng)基卵磷脂加入量的影響。當(dāng)卵磷脂的添加量低于0.5 g/L 時，其磷酸酶活性及解磷量隨著卵磷脂添加量增加而增大，添加量為0.5 g/L 時，磷酸酶活性和解磷量分別為240 μmol/(L·min)和430.5 mg/L。其后，隨著卵磷脂添加量增加其磷酸酶活性及解磷量并不增加，而是維持在相對恒定的值。由圖5 可看出，卵磷脂濃度為0.5、0.7 和0.9 mg/L 時，磷酸酶活性及解磷量的差異均不顯著(P＜0.05)。說明WS-FJ9 菌株解有機(jī)磷培養(yǎng)基中添加0.5 g/L 的卵磷脂較為適宜。

3 結(jié)論與討論

確定微生物分泌的磷酸酶定域表達(dá)對于研究有機(jī)磷的降解機(jī)制，開發(fā)有機(jī)磷降解酶制劑具有重要意義。戴樹桂等［12］研究了2 種假單孢菌中二氯酚降解酶的酶學(xué)定域，結(jié)果該2 種菌產(chǎn)生的降解酶均主要定域在膜周及膜內(nèi)。鐘傳青［11］研究了高效解磷菌巨大芽抱桿菌Bacillus megaterium P17 菌株的酶學(xué)定域，結(jié)果該菌酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均為胞外酶，在發(fā)酵過程中大部分被分泌到胞外。陳丹［13］研究了高效解有機(jī)磷細(xì)菌蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus JYZ-SD1 的磷酸酶定域表達(dá)，結(jié)果確定該酶為胞內(nèi)酶。本研究結(jié)果顯示，多噬伯克霍爾德氏菌B.multivorans WS-FJ9 分泌酸性磷酸酶和堿性磷酸酶，且以分泌酸性磷酸酶為主。胞外、胞內(nèi)和膜周酸性磷酸酶活性分別為71.8、32.1 和16.5 μmol/(L·min);胞外、胞內(nèi)和膜周堿性磷酸酶活性分別為22.8、8.5 和13.2 μmol/(L·min)。因此Burkholderia multivorans WS-FJ9酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均定域為胞外酶。這和鐘傳青的研究結(jié)果一致而與陳丹的結(jié)果不同，原因可能是由微生物控制降解酶的基因不同所致。至于該菌磷酸酶的基因定位，有待于進(jìn)一步研究。

不同微生物分泌的降解酶的酶特性有很大差異，對營養(yǎng)及環(huán)境條件的要求也各不相同。因此，本研究分別探討了不同碳源、氮源、磷源以及培養(yǎng)基中不同卵磷脂濃度等不同的營養(yǎng)條件對多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9 磷酸酶活性和解有機(jī)磷能力的影響。結(jié)果表明，該菌株解有機(jī)磷的最適碳、氮和磷源分別為葡萄糖、硫酸銨和卵磷脂，降解培養(yǎng)基中卵磷脂的最適濃度為0.5 g/L。硝酸銨和硫酸銨均可提供銨態(tài)氮源，但本研究中硫酸銨效果顯著優(yōu)于硝酸銨，推測其原因可能是硝酸銨中的硝酸根或其轉(zhuǎn)化而來亞硝酸根對細(xì)菌生長產(chǎn)生了某種抑制作用。同時研究還發(fā)現(xiàn)，植酸鈣和草甘膦均可作為磷源被該菌利用，這在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境治理中具有重要的意義，該菌不但可用于土壤中植酸鹽的降解而且還可應(yīng)用于環(huán)境中草甘膦農(nóng)藥殘留的治理。因此，本研究為生物菌肥和解磷酶制劑的研發(fā)與生產(chǎn)，以及農(nóng)藥殘留的生物降解均提供了一定的參考依據(jù)。

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