房耀維, 劉 姝, 王淑軍, 呂明生, 焦豫良, 陳國強(qiáng), 潘建梅, 牛 軍

(淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005)

天然產(chǎn)物是開發(fā)新藥或重要先導(dǎo)化合物的主要源泉之一[1-2]。聚酮 (Polyketide) 化合物是功能和結(jié)構(gòu)最多樣化的天然產(chǎn)物之一, 具有包括抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗病原生物、抗結(jié)核和免疫抑制等生物活性[3]。迄今, 通過活性追蹤指導(dǎo)從微生物發(fā)酵液中純化聚酮化合物, 然后進(jìn)行化學(xué)分析仍是發(fā)現(xiàn)新型聚酮化合物的主要策略, 隨著研究的進(jìn)行, 盡管篩選微生物的范圍從陸地拓展到了海洋, 重復(fù)發(fā)現(xiàn)率仍越來越高, 越來越難發(fā)現(xiàn)新的聚酮化合物, 因此, 亟待開發(fā)更為快速有效的新型聚酮化合物篩選策略[4-5]。

基因組發(fā)掘(Genome mining)是利用現(xiàn)代生物信息學(xué)手段從基因組序列中尋找和識別特定功能基因或基因簇的技術(shù)[6]。基因組發(fā)掘表明, 即使是對天然被廣泛研究的細(xì)菌而言, 發(fā)現(xiàn)的次級代謝產(chǎn)物種類也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于基因組發(fā)掘獲得的次級代謝產(chǎn)物基因簇[7-8]。隨著基因測序技術(shù)的飛速發(fā)展, 基因組序列測定速度提高, 成本降低, 海量的微生物基因組序列和宏基因組序列被測定[9]。通過基因組發(fā)掘技術(shù)發(fā)掘天然產(chǎn)物基因簇技術(shù)發(fā)展迅速, 促使基因組發(fā)掘成為更加準(zhǔn)確高效的新型聚酮化合物篩選策略[10]。通過基因組發(fā)掘技術(shù), 越來越多的新穎基因簇被發(fā)掘, 從而引導(dǎo)大量的新型聚酮化合物被發(fā)現(xiàn)和研究[11-12]。新穎基因簇既為異源表達(dá)提高次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)效率奠定基礎(chǔ), 也為闡明活性物質(zhì)代謝途徑, 從而通過代謝工程為提高生產(chǎn)效率奠定基礎(chǔ), 同時(shí)又為通過組合生物合成技術(shù)對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造提供了基因序列信息[13]。

目前, 已知的具有生物活性的聚酮類化合物的2/3是放線菌產(chǎn)生的[3]。海洋放線菌代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和活性多樣更加豐富多樣[14]。2005年, 首個(gè)專性海洋放線菌屬鹽孢菌屬 (Salinosporasp.) 報(bào)道, 該屬放線菌可以產(chǎn)生豐富的聚酮化合物[8]。2007年, 菌株S.tropicaCNB440 和菌株S.arenicolaCNS-205基因組序列被測定, 是專性海洋放線菌的首次全基因組測序, 打開了海洋放線菌基因組發(fā)掘之門。對兩個(gè)菌株的基因組序列進(jìn)行發(fā)掘, 共發(fā)現(xiàn)了包括PKS、NPRS、siderophore、melanin、terpenoid 和 aminocyclitol 等 49 個(gè)次生代謝產(chǎn)物基因簇 (Orphan gene cluster), 其中, 只有9個(gè)基因簇發(fā)現(xiàn)了代謝產(chǎn)物[15]。根據(jù)獲得基因簇信息, Moore 研究組從鹽孢菌屬放線菌發(fā)現(xiàn)了Salinosporamide K[16], Lomaiviticin[17]和 Cyanosporasides C-F[18]。菌株S.arenicolaCNP-193 具有良好的抗菌活性, 利用 molecular networking技術(shù)對 35株鹽孢菌屬菌株進(jìn)行測定, 發(fā)現(xiàn)菌株CNP193能產(chǎn)生不同于其他菌株的新穎代謝產(chǎn)物。因此, 作者以S.arenicolaCNS 205 基因組中含有的基因簇為參照, 發(fā)掘菌株S.arenicolaCNP193 基因組中新穎的 PKS 和 NRPS 基因簇, 并對基因簇進(jìn)行比較分析, 為基因簇的異源表達(dá), 基因簇的功能鑒定及新型聚酮化合物的發(fā)現(xiàn)提供信息。

1 材料與方法

1.1 新穎PKS 和NRPS 基因簇發(fā)掘

將S.arenicolaCNS 205基因組序列和S.arenicolaCNP193 基因組序列提交 antiSmash 在線網(wǎng)站(http: //www.secondarymetabolites.org/)預(yù)測和分析次級代謝產(chǎn)物基因簇, 通過 NRPS-PKS knowledgebase (http: //www.nii.ac.in/~pksdb/sbspks/master.html)對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證后, 初步篩選出二者不同的PKS及NRPS基因簇[10]。進(jìn)一步利用NCBI BLAST對初篩新穎基因簇的基因序列進(jìn)行比對分析, 獲取沒有較高基因序列相似性的基因簇[12]。利用 NapDos(http: //napdos.ucsd.edu/) 對基因簇中的 KS domain和 C domain 的進(jìn)化進(jìn)行分析[9]。

1.2 新穎PKS 和NRPS 基因簇的功能預(yù)測

根據(jù) antiSmash搜索已知功能的同源基因簇,并預(yù)測基因簇中生合成基因?qū)?yīng)產(chǎn)物的核心結(jié)構(gòu),初步判斷基因簇代謝產(chǎn)物, 利用NCBI BLAST對基因簇所有同源序列進(jìn)行搜索, 最后利用NapDos對基因簇中的 KS domain 和 C domain 的進(jìn)化進(jìn)行分析, 獲悉 KS domain 和 C domain 的催化功能, 綜合確定產(chǎn)物的類型及結(jié)構(gòu)信息。

2 結(jié)果

2.1 S.arenicola CNP193 基因組中PKS 和NRPS 基因簇預(yù)測與分析

通過 antiSmash 預(yù)測, 并經(jīng)過 NRPS-PKS knowledgebase 進(jìn)一步驗(yàn)證的S.arenicolaCNP193 基因組中次級代謝產(chǎn)物基因簇如表1。在菌株S.arenicolaCNP193 基因組序列中共發(fā)現(xiàn)次級代謝產(chǎn)物基因簇23個(gè), 其中t1PKS 基因簇4個(gè), t2PKS 基因簇和 t3PKS 基因簇各 1 個(gè), NRPS 基因簇3個(gè), NRPSPKS基因簇2個(gè)。

2.2 S.arenicola CNP193 基因組中新穎PKS和NRPS 基因簇的篩選

菌株S.arenicolaCNS 205基因組序列中共有次級代謝產(chǎn)物基因簇 25 個(gè), 其中 t1PKS 基因簇7 個(gè), t2pks 基因簇和 t3PKS 基因簇各1個(gè), NRPS基因簇 4 個(gè), NRPS-PKS 基因簇2個(gè)。Nett等[15]報(bào)道菌株S.arenicolaCNS 205中已經(jīng)明確功能的基因簇有5個(gè), 對應(yīng)產(chǎn)物分別為 利福霉素、星孢菌素、去鐵敏、Lymphostin 和Cyclomarin。根據(jù)Nett等[15]報(bào)道基因簇信息和 antiSmash 推測的S.arenicolaCNS 205基因組中的次級代謝產(chǎn)物基因簇, 找到S.arenicolaCNS 205中5個(gè)明確基因簇功能的包括編號, 產(chǎn)物類型和大小等基因簇信息, 并了解基因簇的結(jié)構(gòu)組成 (圖1) 。根據(jù)這些信息從菌株S.arenicolaCNP193基因組中尋找產(chǎn)物類型相同, 大小和結(jié)構(gòu)組成相似度較高的基因簇。中和S.arenicolaCNS 205中5個(gè)明確功能的基因簇均能在菌株S.arenicolaCNP193中找到對應(yīng)的基因簇 (表2)。除Rifamycin 基因簇外, 兩菌株中星孢菌素、去鐵敏、Cyclomarin 和 Lymphostin的基因簇大小相同, 結(jié)構(gòu)組成基本相同, 序列相似度高于 99%。雖然菌株S.arenicolaCNS 205 中利福霉素 基因簇較菌株S.arenicolaCNP193中對應(yīng)的基因簇大20 kb, 但是S.arenicolaCNP193與對應(yīng)大小S.arenicolaCNS 205中的基因簇相似性高達(dá) 99%。且二者 antiSmash 在線預(yù)測兩個(gè)基因簇的核心結(jié)構(gòu)只是在中間位置有 3個(gè)組成單位不同(圖2), 因此推測S.arenicolaCNP193的基因簇產(chǎn)物屬于Rifamycin同系物。

根據(jù)基因簇產(chǎn)物類型, 大小和結(jié)構(gòu)組成, 以及antiSmash 在線預(yù)測的基因簇產(chǎn)物核心結(jié)構(gòu), 判斷菌株S.arenicolaCNP 193基因組中基因簇是否在S.arenicolaCNS 205 中有相同的基因簇, 發(fā)現(xiàn)S.arenicolaCNP193 基因組中具有四個(gè)與S.arenicolaCNS 205 不同的基因簇, 分別為基因簇7, 基因簇 8, 基因簇 10和基因簇 20(表1)。利用 NCBI BLAST 對初篩新穎基因簇的基因序列進(jìn)行比對分析(圖3)?；虼?中98%的序列和S.arenicolaCNS205 中包含基因簇 8的部分序列的相似性高達(dá)達(dá)到99%; 基因簇 7同Micromonospora echinospora的卡里奇霉素基因簇相似性最高, 基因簇 7 中 67%的序列同該序列的相似性為到 81%; 62% 的基因簇10 同S.arenicolaCNS 205 基因組中序列相似性為98%; 基因簇 20 中有 26% 的序列同S.arenicolaCNS 205 基因組中序列相似性為 99%。表明S.arenicolaCNP193基因組中所具有的新穎 PKS和NRPS 基因簇為基因簇7, 基因簇10和基因簇20。

表1 菌株S.arenicola CNP193和菌株S.arenicola CNB 440 基因組序列中的次級代謝產(chǎn)物基因簇Tab.1 The secondary metabolite gene clusters mined from S.arenicola CNP193 and S.arenicola CNB 440

圖1 菌株 S.arenicola CNP193和菌株 S.arenicola CNS 205 基因組序列中已知功能次級代謝產(chǎn)物基因簇結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Modular organization of the gene clusters from S.arenicola CNP193 and S.arenicola CNS 205

表2 菌株 S.arenicola CNP193和菌株 S.arenicola CNS 205 基因組序列中已知功能次級代謝產(chǎn)物基因簇信息比較Tab.2 Information comparison of the gene clusters from S.arenicola CNP193 and S.arenicola CNS 205

圖2 antiSmash 在線預(yù)測菌株 S.arenicola CNP193和菌株 S.arenicola CNS 205 基因組序列中利福霉素基因簇核心結(jié)構(gòu)Fig.2 The core structure of Rifamycin predicting with antiSmash based on gene cluster of S.arenicola CNP193 and S.arenicola CNS 205

圖3 Blast搜索基因簇同源序列Fig.3 Homologous gene clusters searching with Blast

2.3 基因簇7

基因簇 7 屬于 t1PKS, 位于基因組的 2036897–2082794, 長度約為 46 kb?；虼氐臉?gòu)成見圖4。antiSmash 預(yù)測已知功能同源關(guān)系最近的基因簇序列為卡里奇霉素, maduropeptin和新制癌菌素, 都屬于烯二炔化合物(圖5)。NCBI BLAST對基因組序列進(jìn)行比對分析, 表明基因簇 7 同M.echinospora的 卡里奇霉素 基因簇相似性最高, 基因簇 7 中67% 的序列同該序列的相似性達(dá)到 81%。而只是同S.arenicolaCNS 205 和S.tropicaCNB 440 只是在基因簇的兩端有較高的重復(fù)序列(圖3)。利用 Nap-Dos 對圖3 所示的基因簇中的 KS domain 蛋白序列進(jìn)行同源性分析, 結(jié)果見表3。該 KS domain 和M.echinospora菌株的 卡里奇霉素基因簇中的 CALEAM_AAM94794_ene10 (KS domain)蛋白質(zhì)序列相似性為89%, 屬于烯二炔家族, 由 Ahlert 等 2002 年報(bào)道[19]。初步表明基因簇7為烯二炔類化合物基因簇。

2.4 基因簇10

基因簇10 屬于寡糖-t1pks-nrps-五肽, 位于基因組的 2254459–2343659, 長度為 89.2 kb?；虼氐臉?gòu)成見圖6, 基因簇中含有 ER domain, KS domain,AT domain 和 DH domain 各一個(gè); A結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域各兩個(gè)。antiSmash 預(yù)測沒有發(fā)現(xiàn)已知功能同源基因簇序列。NCBI BLAST對基因組序列進(jìn)行比對分析結(jié)果見表4, 62% 的基因簇 10 同S.arenicolaCNS 205 基因組中序列相似性為 98%, 30% 的基因簇 10 同M.echinospora基因組中序列相似性為98%。對基因簇中KS domain和C domain的蛋白序列利用NapDos分析, 結(jié)果見表5。和基因簇7中的KS domain 類似, 該 KS domain和M.echinospora菌株的 卡里奇霉素 基因簇中的 KS domain 蛋白質(zhì)相似性為 88%。兩個(gè)C domain均屬于LCL家族, 同S.tropica合成 sporolide A 的基因簇中的C domain 的相似性分別為 34%和43%。

2.5 基因簇20

基因簇 20 屬于 NRPS-t1PKS, 位于基因組的3923744–3981049, 長度約為57.3 kb?；虼氐臉?gòu)成見圖7, 基因簇中含有C domain 4個(gè), A domain 3個(gè)。雖然 antiSmash 預(yù)測沒有發(fā)現(xiàn)已知功能同源基因簇序列, 但是成功的預(yù)測了基因簇對應(yīng)產(chǎn)物的核心結(jié)構(gòu)為三個(gè)半胱氨酸縮合物(圖8)。NCBI BLAST對基因組序列進(jìn)行比對分析, 26% 的基因簇序列同S.arenicolaCNS 205 基因組中序列相似性為 99%,5% 的基因簇序列 同Verrucosispora marisAB-18-032 基因組中序列相似性為 80%。對基因簇中KS 結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域的蛋白序列利用在線工具NapDos分析, 結(jié)果見表6。KS1 domain 屬于雜和KS domain, 同菌株Sorangium cellulosumSo ce90產(chǎn) epothilone 基因簇中的編號為 EpoC_Q9L8C8_H的 KS domain[20]的相似度達(dá)58%。C1 domain 和Bacillus licheniformisATCC 10716產(chǎn)bleomycin的bacit1_C1_cyc domain[21]相似度為 36%; C2, C3,C4均和Streptomyces verticillusATCC15003 的bleom9_C2_cyc domain[22]相似度分別為45%, 44%和 46%。

圖4 基因簇7的結(jié)構(gòu)組成Fig.4 Modular organization the gene cluster 7

圖5 antiSmash比對獲得的基因簇7同源基因簇Fig.5 The Homologous gene clusters searching with antiSmash

表3 NapDos分析基因簇7中KS domain 的同源蛋白序列Tab.3 Homologous protein sequences of KS domain from gene cluster 7 searching with NapDos

圖6 基因簇10結(jié)構(gòu)組成Fig.6 Modular organization of the gene cluster 10

表4 NCBI blast 基因簇10同源序列Tab.4 Homologous sequences of gene cluster 10 with NCBI blast

表5 NapDos分析基因簇10中KS domain h和C domain 的同源蛋白序列Tab.5 Homologous protein sequences of KS domain and C domain from gene cluster 10 searching with NapDos

3 討論

3.1 PKS及NRPS 基因簇的挖掘

基因組挖掘技術(shù)在搜尋新穎微生物次級代謝產(chǎn)物方面優(yōu)勢明顯, 聚酮 (Polyketide) 化合物具有多種生物活性, 是新藥開發(fā)的最重要前體化合物之一,因此通過基因組發(fā)掘技術(shù)發(fā)掘新穎PKS及NRPS基因簇成為研究熱點(diǎn)。有關(guān)PKS及NRPS基因的數(shù)據(jù)庫, 發(fā)掘新穎PKS及NRPS的軟件和在線網(wǎng)站逐年增多, 即可以對基因框架, 宏基因組序列, 以及整個(gè)基因組范圍內(nèi)的PKS及NRPS基因簇進(jìn)行篩選, 對基因簇的進(jìn)化及來源進(jìn)行探索, 又可以對基因簇的組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 對代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)初步預(yù)測[23-24]。

圖7 基因簇20結(jié)構(gòu)組成Fig.7 Modular organization of the gene cluster 20

表6 NapDos分析基因簇20中KS domain h和C domain 的同源蛋白序列Tab.6 Homologous protein sequences of KS domain and C domain from gene cluster 20 searching with NapDos

圖8 antiSmash 在線預(yù)測基因簇20對應(yīng)產(chǎn)物的核心結(jié)構(gòu)Fig.8 The core structure of gene cluster 20 predicting with antiSmash

發(fā)掘的技術(shù)核心是在收集盡量多的 PKS及NRPS基因簇序列信息, 在分析不同基因簇的結(jié)構(gòu)組成, 催化單元, 相關(guān)酶及底物高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上, 利用對基因或蛋白序列的多重比對, 以及不同的運(yùn)算法則對功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行檢索分析, 從而識別待測基因組中PKS及NRPS基因簇, 并對其功能進(jìn)行推測[25]。Antismash 是美國, 德國, 英國及和荷蘭等研究者開發(fā)的微生物次級代謝代謝產(chǎn)物預(yù)測及分析網(wǎng)站, 幾經(jīng)升級, 可以對包括PKS及NRPS在內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物基因簇進(jìn)行識別和分析[10]。NRPS-PKS knowledgebase是專門的 NRPS, PKS數(shù)據(jù)庫, 用于分析NRPS, PKS和NRPS/PKS雜合基因簇及其結(jié)構(gòu)等。因此, 本研究在利用 antiSmash 識別篩選基因簇的基礎(chǔ)上, 利用NRPS-PKS knowledgebase驗(yàn)證, 提高基因簇預(yù)測的準(zhǔn)確性。

3.2 基因簇的新穎性確定

基因簇的新穎性是指基因簇生物合成基因, 調(diào)控基因等基因本身或排布不同, 從而更趨向于合成新穎的代謝產(chǎn)物。以S.arenicolaCNS 205為對照, 利用同一網(wǎng)站對S.arenicolaCNP-193基因簇的發(fā)掘,比較基因簇的結(jié)構(gòu)結(jié)合基因簇的大小, 可以最大限度的去除相同基因簇。S.arenicolaCNS 205的基因簇8比S.arenicolaCNP-193基因簇9大接近20 kb,但是大部分組成結(jié)構(gòu)相近, 認(rèn)為是相同基因簇。S.arenicolaCNP-193中, 基因簇 8(2128462-2175754)和基因簇 9(2159970-2225471)有約 16Kb的重合區(qū)域。這是由于antiSmash最大程度的預(yù)測可能次級代謝產(chǎn)物基因簇, 部分基因序列和其前后的基因序列都能形成基因簇, 因此會(huì)有預(yù)測基因簇重合現(xiàn)象。

通過NCBI Blast 比對獲得基因簇基因序列, 發(fā)現(xiàn)S.arenicolaCNP-193基因簇8中98%的序列和S.arenicolaCNS 205中包含部分基因簇8的序列相似性高達(dá)達(dá)到99%。說明S.arenicolaCNP-193基因簇8不具新穎性, 同時(shí)也表明S.arenicolaCNP-193基因簇8沒有在S.arenicolaCNS 205預(yù)測為次級代謝產(chǎn)物基因簇, 是由于其部分序列包含在了S.arenicolaCNS 205中基因簇9中?；虼?0和基因簇20和其他基因序列的同源性較低。通過NapDos比對基因簇中KS domain和C domain的蛋白序列, KS domain與其他KS domain蛋白質(zhì)序列相似性低于80%,C domain 與其他C domain 蛋白質(zhì)序列相似性低于50%, 進(jìn)一步證明基因簇的新穎性。

3.3 新穎基因簇的對應(yīng)產(chǎn)物預(yù)測

基因簇對應(yīng)產(chǎn)物可以通過搜索基因或蛋白同源序列進(jìn)行預(yù)測, 也可以根據(jù)基因簇中生物合成基因的構(gòu)成及其編碼酶的催化功能進(jìn)行預(yù)測。antiSmash,NCBI Blast以及NapDos對基因簇中的KS domain的比對分析都表明基因簇7和M.echinospora菌株的卡里奇霉素有最高同源性。卡里奇霉素結(jié)構(gòu)見圖9, 屬于烯二炔類抗腫瘤抗生素。烯二炔類抗生素對腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用。一般比阿霉素、絲裂霉絲等強(qiáng)1000倍以上。作為新型抗腫瘤物質(zhì), 烯二炔類抗生素受到廣泛重視[26]。Scripps海洋研究所生物技術(shù)與生物醫(yī)藥研究中心從于2006年從S.pacifica發(fā)酵產(chǎn)物中分離了烯二炔類化合物 cyanosporasides A-B, 2013年, 分離獲得了 cyanosporasides C-F, 并對產(chǎn)生該類化合物的基因簇基因簇進(jìn)行了比較和結(jié)構(gòu)分析[18]。除此以外, 尚未從Salinispora屬發(fā)現(xiàn)新的烯二炔類化合物?；虼?7 的發(fā)現(xiàn), 表明S.arenicolaCNP193有可能產(chǎn)生新穎的烯二炔類抗腫瘤抗生素。

圖9 卡里奇霉素結(jié)構(gòu)Fig.9 The structure of calicheamicin

antiSmash, NCBI Blast沒有發(fā)現(xiàn)已知功能的同源基因簇。NapDos對基因簇10中的KS domain和C domain的比對分析都表明, KS domain 和M.echinospora菌株的卡里奇霉素基因簇中的 KS domain有最高同源性, 兩個(gè)C domain 均屬于LCL家族, 同S.tropica合成sporolide A的基因簇中的C domain 同源。但是根據(jù)這些信息, 尚不能預(yù)測相應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

antiSmash預(yù)測了基因簇 20不考慮是否發(fā)生環(huán)化反應(yīng)是的核心結(jié)構(gòu), 由半胱氨酸縮合而成。KS domain和C domain和EpoC_Q9L8C8_H, bacit1_C1_cyc, bleom9_C2_cyc相似度最高, 分別在合成埃博霉素 A, 桿菌肽 A以及博來霉素的中催化半胱氨酸之間及半胱氨酸與其他氨基酸之間的縮合成噻唑環(huán)。埃博霉素 A為大環(huán)內(nèi)酯類抗癌藥物[24], 桿菌肽 A為抗菌脂肽[25], 博來霉素為糖肽抗癌藥物[26]。三者結(jié)構(gòu)見圖10, 均具有噻唑環(huán), 因此可初步摧測基因簇20對應(yīng)產(chǎn)物為含有噻唑環(huán), 有半胱氨酸及其他氨基酸參與合成的肽類化合物。

圖10 埃博霉素A, 博來霉素和桿菌肽A的結(jié)構(gòu)Fig.10 The structure of epothilone A, bleomycin, and bacitracin

致謝:

感謝加州大學(xué)圣地亞哥分院Scripps海洋研究所生物技術(shù)與生物醫(yī)藥研究中心 Jensen R Paul 教授提供菌株Salinispora arenicolaCNP193基因組信息。

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