李航，陳小泉，杜鋼，姜衛(wèi)東

（四川省食品藥品檢驗檢測院，成都 611731）

隨著中國經(jīng)濟和社會的發(fā)展，人民越來越關(guān)注健康和養(yǎng)生問題，保健食品的開發(fā)順應了這個需求，也給人民帶來了益處。但隨著商業(yè)競爭的加劇和人們對保健功效作用的看重，不良生產(chǎn)企業(yè)向保健食品中非法添加藥物的行為愈演愈烈。為了有效打擊和查處此種行為，保障人民食用保健食品的安全，維護保健食品市場的正常秩序，本文擬建立抗疲勞保健食品中非法添加西地那非類藥物的檢測方法。

對保健食品中西地那非類藥物的檢測，傳統(tǒng)的分析方法還是采用反相高效液相色譜，用保留時間結(jié)合光譜掃描圖譜來定性，用峰面積外標法定量測定。隨著分析儀器技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在更趨向于液質(zhì)聯(lián)用定性、定量同時測定，不管是三重四級桿質(zhì)譜還是離子阱質(zhì)譜等，對定性的準確判定都起到了確證的作用[1]。對保健食品中西地那非類藥物的非法添加檢測，國內(nèi)普遍還是做一個或幾個化合物，本文同時檢測11個化合物。

1 儀器、試劑、樣品

LC-Agilent 1200 /MS- QQQ 6460 （美國安捷倫科技有限公司）

甲醇、乙腈為色譜純(Fisher Chemicals)，水為超純水，其余試劑為分析純，那紅地那非（Toronto Research Chemicals, lot:14-MVI-133-2 ）、紅地那非（Toronto Research Chemicals, lot:11-MVI-164-1 ）、氨基他達拉非（Toronto Research Chemicals, lot:4-WSM-124-1 ）、羥基豪莫西地那非（Toronto Research Chemicals, lot:4-MVP-122-2）、鹽酸伐地那非三水合物（Dr.Ehrenstorfer GmbH, lot:91222）、豪莫西地那非（Toronto Research Chemicals, lot:11-MVI-176-1）、硫代艾地那非（廣州奕源生物科技有限公司，批號201009001）、那莫西地那非（Toronto Research Chemicals, lot:14-MVI-127-1）、枸櫞酸西地那非（Toronto Research Chemicals, lot:3-ARP-69-1 ）、他達拉非（Toronto Research Chemicals, lot:8-SSR-172-1）、偽伐地那非（Toronto Research Chemicals, lot:1-BIN-18-2）。

樣品：具有抗疲勞功能的保健品（A、B、C、D）

2 實驗方法

2.1 混合對照工作液的制備

精密稱取上述11種對照品，分別置各量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。取各對照品儲備液適量，置同一量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品工作液（各對照品濃度分別約為5 μg/ml）。

2.2 樣品制備

2.2.1 固體制劑

取樣品混勻，研細，取相當于一次口服劑量的樣品，置25mL量瓶中，加乙腈20mL，超聲處理15分鐘，放置至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm濾膜，即得。

2.2.2 液體制劑

取相當于一次口服劑量的樣品，置50mL量瓶中，加乙腈適量，振搖3分鐘，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm濾膜，即得。

2.3 液相分析條件建立

通過優(yōu)化流動相及液相洗脫梯度達到11種化合物的基線分離[2][5]。

色譜柱：Agilent，XDB-C18，5μm，4.6×250mm，[進樣量]20 μl；

柱溫：35℃；流速：0.8 ml/min；檢測波長：230nm；分流比：液相-質(zhì)譜= 3：2；

流動相 A： 甲醇（含15%乙腈）；

B：0.02mol/L 乙酸銨溶液（含15%乙腈、0.1%乙酸）

表1 液相梯度洗脫程序

2.4 液質(zhì)聯(lián)用分析條件建立

通過優(yōu)化質(zhì)譜離子源參數(shù)及一級、二級質(zhì)譜掃描參數(shù)，對11種化合物進行質(zhì)譜檢測[3][4][6]，見表2~表4。

2.5 數(shù)據(jù)采集及定性判定

對照品溶液和供試品溶液各進樣20 μl，按上述儀器條件記錄UV和MS信號。

表2 ESI離子源參數(shù)（正模式）

表3 一級質(zhì)譜掃描參數(shù)

表4 二級質(zhì)譜掃描參數(shù)

2.6 定量計算及檢出限

若定性判定檢出，則用液相色譜數(shù)據(jù)外標校正因子法計算檢出目標化合物的濃度。

若定性判定未檢出，則取混合對照溶液稀釋2倍注入LCMS，測得信噪比。按S/N=3:1，計算檢出限。

2.7 實樣檢測

將市售具有抗疲勞功能的保健品（A、B、C）按上述建立的方法，進樣20 μl，LC-MS聯(lián)用分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 混合對照

由圖1看出，11種對照品在一個液相梯度洗脫條件下，各色譜峰均達到基線分離，說明優(yōu)化后采用的色譜條件適合11種化合物的同時分離。

圖1 11種對照品化合物的HPLC圖

圖2 11種化合物的EIC圖

從圖2提取離子色譜峰看出，通過色譜峰的保留時間及特征質(zhì)量數(shù)的離子可以初步判斷樣品中是否含有目標化合物。即若樣品中出現(xiàn)的色譜峰，其保留時間及離子的特征質(zhì)量數(shù)與對照品都一致，則做二級質(zhì)譜進一步確證。

3.2 檢出限

表5 11種化合物的檢出限

保健食品中非法添加化學藥物，為了達到效果一般都要加入至微量以上的水平，由表5看出，建立的液相色譜外標法定量方法，其檢測限濃度均在1μg/ml以下的水平，完全滿足含量測定的定量要求。

3.3 樣品測定結(jié)果

圖3 4批樣品的TIC-VWD圖

由圖3看出，樣品A及樣品C在與對照品出峰的相同保留時間處未見色譜峰，判定為未檢出所查的11種化合物。樣品B出現(xiàn)2個與對照品保留時間相同的色譜峰，疑似檢出2個對照品化合物。

圖4 樣品B的一級質(zhì)譜圖

由圖4看出，樣品B中的西地那非及他達拉非一級質(zhì)譜圖與對照品的一級質(zhì)譜圖一致，初步判定樣品中檢出上述2個化合物。

圖5 對照品的二級質(zhì)譜圖

圖6 樣品B的二級質(zhì)譜圖

由圖5、圖6看出，樣品B中的西地那非及他達拉非二級質(zhì)譜圖與對照品的二級質(zhì)譜圖一致，確證判定樣品中檢出上述2個化合物。

表6 4批樣品定性檢測結(jié)果

表7 樣品B 所查化合物定量檢測結(jié)果

4 討論與結(jié)論

保健食品中違法添加的檢測和查處，一直是保健食品分析檢測的一項重要任務和有難度的工作。為了讓保健食品具有標識的功效，不法生產(chǎn)企業(yè)會向產(chǎn)品中添加藥用化學成分。為了準確的定性定量，本文采取了液質(zhì)聯(lián)用，同時定性定量檢測的分析方法，快速高效?；诟咄繖z測的需要及考慮保健食品生產(chǎn)工藝的基本特點，本文從樣品快速制備到準確分析檢測整個過程作了有益的嘗試，建立的方法符合食品檢測法規(guī)的技術(shù)要求，測定了幾批市場上的實際樣品，結(jié)果準確可靠。

本方法對標識具有抗疲勞功效的保健食品非法添加西地那非類藥物的分析檢測具有參考意義，對保健食品中非法添加其他化學成份的分析檢測提供一定的方法思路借鑒。

[1]陳安珍, 王尊文, 楊釗, 等. UPLC-MS/MS檢測補腎壯陽類中成藥及保健品中添加的化學藥. 中成藥, 2009,31(11): 1712-1714.

[2]邢俊波, 曹紅, 張炯, 等. 高效液相色譜法同時測定補腎壯陽類中成藥及保健食品中非法添加7 種化藥成分. 時珍國醫(yī)國藥,2014,25(2): 451-453.

[3]高詠莉, 鄔曉鷗, 肖麗和, 等. HPLC-MS/MS法測定補腎壯陽類藥品或保健品中非法添加羥基豪莫西地那非的研究. 中成藥,2009,31(7): 1058-1060.

[4]張翠英, 李振國, 徐金鈴. UPLC/MS/MS法檢測補腎壯陽類中成藥中非法添加枸櫞酸西地那非的定性定量研究. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2007,17(10): 1741-1743.

[5]來國防, 程賓. 補腎壯陽類中藥制劑中非法添加化學藥物成分的檢測. 中國藥業(yè), 2010,19(22): 32-34.

[6]劉暢, 夏晶, 胡青, 等. LC/MS(n)法檢測補腎壯陽類中成藥和保健食品中非法添加5種性功能類化學藥品. 中成藥, 2009,31(9):1371-1374.