劉紅輝，李敏，汲紅麗，衛(wèi)東，孫利芹

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005）

多糖是一類(lèi)具有多種生物活性的天然大分子物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、化妝品等多方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值。目前對(duì)多糖的功能研究主要集中在植物類(lèi)、真菌和大型海藻、甲殼類(lèi)等，例如透明質(zhì)酸、蘆薈凝膠、甲殼素及其衍生物、肝素等已經(jīng)作為天然活性原料用于化妝品行業(yè)[1-4]。隨著海洋微藻生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是考慮到海洋微藻的生長(zhǎng)特性，人們將研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向海洋微藻多糖的研究。微藻多糖是一種存在于微藻細(xì)胞內(nèi)或胞外的具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射等獨(dú)特生物活性的天然大分子物質(zhì)，目前研究較多的主要有螺旋藻多糖、鹽藻多糖等[5-7]。由于多糖具有良好的成膜性能，可以減少水分蒸發(fā)，因此將其作為功能性添加劑在食品、化妝品領(lǐng)域中將有廣泛應(yīng)用前景。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)微藻多糖的吸濕性及保濕性能均鮮有報(bào)道，丁紅霞等[6]研究了杜氏鹽藻多糖在皮膚護(hù)理中的作用；我們研究了一種金藻多糖的吸濕、保濕功能[8]，都顯示了良好的效果。

紫球藻多糖是由單細(xì)胞紅藻紫球藻生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后向細(xì)胞外分泌的一種水溶性黏多糖，一些學(xué)者已經(jīng)報(bào)道了紫球藻多糖的抗病毒、降膽固醇、抗輻射和抗腫瘤作用[9-10]。我們前期已經(jīng)對(duì)紫球藻胞外多糖的理化性質(zhì)及抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及自由基清除能力進(jìn)行了深入研究[11-12]，但尚未有紫球藻多糖吸濕、保濕性能的研究報(bào)道。本研究主要考察紫球藻胞外多糖及其降解產(chǎn)品的總抗氧化能力、吸濕性和保濕活性，以期為海洋微藻多糖作為精細(xì)化工原料或功能食品基料應(yīng)用于化妝品、食品行業(yè)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紫球藻（Porphyridium cruentum）實(shí)驗(yàn)用藻株由煙臺(tái)大學(xué)微藻生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室純化并保存，紫球藻胞外多糖（EPS0）由煙臺(tái)大學(xué)微藻生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 方法

1.2.1 紫球藻胞外多糖的降解與純化

采用超聲輔助H2O2-VC體系誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基降解紫球藻胞外多糖，稱(chēng)取100 mg多糖，加入各10 mL的抗壞血酸和30%的雙氧水，加蒸餾水使反應(yīng)體系的終體積為22 mL。抗壞血酸和雙氧水所選用的終濃度如表1所示。

表1 降解因素水平表Table 1 List of degradation factors and levels

1.2.2 紫球藻胞外多糖及降解產(chǎn)品理化性質(zhì)的測(cè)定

分別采用苯酚-硫酸法[13]、咔唑-硫酸法[14]測(cè)定各組分多糖樣品的總糖量、硫酸基和糖醛酸含量。

苯酚－硫酸法測(cè)定的多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=0. 5639x+0. 0338，R2=0. 9931

咔唑-硫酸法測(cè)定糖醛酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=0. 4848x+0. 0136，R2=0. 9811

1.2.3 高效液相體積色譜排阻法測(cè)定分子量[15]

色譜條件：色譜柱：TSKGel-5000Pw和TSKGel-4000Pw 串聯(lián)（10 μm，7.5 mm×300 mm），示差檢測(cè)器溫度為35℃，進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相：雙重水，流速為0.8 mL/min，分析時(shí)間為30 min。

樣品處理：將被測(cè)樣品配成0.2%的溶液，0.22 μm濾膜過(guò)濾后，取20 μL濾液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品分子量。

（1）線(xiàn)性關(guān)系考察：分別精密吸取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品和去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品混合溶液2、4、6、8、10、12 μL 進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，木香烴內(nèi)酯回歸方程為Y＝2×106 X－33 173，r＝0.999 5；表明木香烴內(nèi)酯在0.4～2.4 μg內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系；去氫木香內(nèi)酯回歸方程為Y＝1×106 X－56 577，r＝0.999 7；結(jié)果表明去氫木香內(nèi)酯在0.4～2.4 μg內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.2.4 多糖樣品的總抗氧化能力測(cè)定[16]

取不同濃度梯度的多糖樣品2 mL，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和3 mL濃度為1%鐵氰化鉀溶液充分混合，在30℃水浴中保溫40 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，搖勻，4000r/min離心20min，移取3mL上清液于試管中，加3 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1%FeCl3，室溫下避光反應(yīng)40min，在700nm處測(cè)定吸光值。以相同的濃度梯度VC作為對(duì)照，按照上述方法檢測(cè)。

1.2.5 多糖樣品的吸濕活性測(cè)定[17]

將待測(cè)樣品、對(duì)照品及多個(gè)稱(chēng)量瓶置于真空干燥箱內(nèi)，50℃烘24 h，準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥后的EPS0、甘油、透明質(zhì)酸和殼聚糖各1.00 g于稱(chēng)量瓶中，在環(huán)境溫度為20℃的條件下，將200 mL飽和氯化鈉溶液加入干燥器底部，并保持干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度為70%。將稱(chēng)取的樣品放入濕度及溫度相對(duì)恒定的干燥器中并密封。每隔8小時(shí)稱(chēng)重一次，并計(jì)算吸濕率。

式中：m0為放置前樣品及稱(chēng)量瓶總質(zhì)量，g；mn為放置n小時(shí)后樣品及稱(chēng)量瓶總質(zhì)量，g；m為所稱(chēng)量樣品的質(zhì)量，g。

1.2.6 多糖樣品的保濕活性測(cè)定[17]

保持環(huán)境溫度為20℃，把250 g變色硅膠置干燥器底部。稱(chēng)取干燥后的 EPS0、EPS1、EPS2、EPS3、甘油、透明質(zhì)酸和殼聚糖各1.00 g于稱(chēng)量瓶，分別向各瓶中加入1.00 mL蒸餾水，充分混勻，置于干燥器。每隔8 h稱(chēng)重一次，并計(jì)算保濕率。

式中：m0為放置前樣品及稱(chēng)量瓶總質(zhì)量，g；mn為放置n h后樣品及稱(chēng)量瓶總質(zhì)量，g；m為所稱(chēng)量樣品和1 mL水的總質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫球藻多糖降解后經(jīng)Sepharose-6B柱層析純化

過(guò)氧化氫—VC反應(yīng)體系中產(chǎn)生大量的羥基自由基使糖苷鍵斷裂來(lái)降解紫球藻多糖，降解后的糖液經(jīng)Sepharose-6B瓊脂糖凝膠層析柱純化，所得的洗脫曲線(xiàn)如圖1所示，所獲得的3個(gè)組份分別命名為EPS1、EPS2和 EPS3。

2.2 多糖組份純度檢測(cè)及分子量測(cè)定

各組分紫球藻多糖經(jīng)高效液相色譜的示差折光檢測(cè)法分析后，所得到的結(jié)果如圖2至圖5所示。

圖1 降解后的紫球藻多糖Sepharose-6B凝膠柱層析洗脫曲線(xiàn)Fig.1 Gel filtration chromatography of degradation of polysaccharides on Sepharose-6B

除EPS2外，其余幾種組分均為單一對(duì)稱(chēng)峰，表明EPS1、EPS3為均一組分；EPS2出現(xiàn)此種現(xiàn)象的原因可能是由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分段收集時(shí)不夠準(zhǔn)確，造成成分在一定程度上的混合。通過(guò)液相所得的Ve求得Kav值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，計(jì)算得出不同組分的多糖的分子量分別為： 3040.88、 1807.59、374.97 和 33.73 ku。

圖2 降解后的紫球藻多糖的高效液相色譜圖Fig.2 High-performance liquid chromatography of degradation of polysaccharides

圖3 EPS1的高效液相色譜圖Fig.3 High-performance liquid chromatography of EPS1

圖4 EPS2的高效液相色譜圖Fig.4 High-performance liquid chromatography of EPS2

圖5 EPS3的高效液相色譜圖Fig.5 High-performance liquid chromatography of EPS3

2.3 紫球藻胞外多糖及降解產(chǎn)品的理化分析

測(cè)得的紫球藻多糖及其降解產(chǎn)品的總糖含量和糖醛酸含量的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 P.cruentum多糖的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical property analysis of polysaccharide from Porphyridium cruentum

如表2所示，EPS0及其降解產(chǎn)品的總糖含量皆在68%以上。采用這一反應(yīng)體系降解得到的多糖，EPS2的糖醛酸含量較低為3.05%，EPS1糖醛酸含量最高，達(dá)11.72%，但糖醛酸含量隨著降解程度的增加出現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，可能的原因是多糖一定程度的降解可以使更多的糖醛酸基團(tuán)暴露，因此測(cè)定的含量增加。但是由于糖醛酸基團(tuán)容易被氧化，隨著降解程度的增加，過(guò)氧化氫濃度也增加，從而使糖醛酸氧化，而表現(xiàn)為測(cè)定濃度降低。

2.4 紫球藻多糖樣品的抗氧化能力測(cè)定

紫球藻多糖樣品的抗氧化能力測(cè)定見(jiàn)圖6。

圖6 紫球藻多糖及其降解產(chǎn)品的抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant activity of polysaccharide and the degraded products

如圖6所示，同一濃度下EPS3與對(duì)照組VC的總還原能力接近。不同組分的紫球藻多糖的總還原能力大小為：EPS3＞ EPS2＞EPS1＞ EPS0。紫球藻多糖各組分的總還原能力隨多糖分子量增大而不斷減小。

2.5 紫球藻多糖樣品吸濕活性的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)以甘油（Gly）、透明質(zhì)酸（HA，分子量100ku）和殼聚糖（CTS，分子量50 ku）為對(duì)照品。在環(huán)境溫度為20℃，相對(duì)濕度為70%的恒溫恒濕環(huán)境下，考察了紫球藻多糖及對(duì)照品的吸濕性能見(jiàn)圖7。

圖7 EPS0、甘油、透明質(zhì)酸和殼聚糖的吸濕率Fig.7 Absorption rate of ESPS0，glycerin,hyaluronic acid and chitosan

如圖7所示，樣品及對(duì)照品的吸濕率大小的順序?yàn)椋篏ly＞ ESPS0＞CTS＞ HA。紫球藻多糖樣品及對(duì)照品的吸濕能力在30 h內(nèi)增長(zhǎng)迅速，30 h后除EPS0和Gly的吸濕能力繼續(xù)增強(qiáng)外，其余對(duì)照樣品的吸濕率基本趨于飽和，且Gly吸濕率的增長(zhǎng)幅度大于EPS0。180 h即實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，EPS0、Gly、CTS和 HA的吸濕率分別為29.00%、52.90%、14.26%和10.46%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：EPS0、CTS和HA的吸濕率均明顯小于Gly，分別小23.9%、38.64%和42.44%，且EPS0的吸濕率比CTS和HA的大，分別大14.74%和18.54%。因甘油中含3個(gè)-OH，親水性極強(qiáng)故其雖為小分子但依然有很大的吸濕率，此外EPS0也表現(xiàn)出了較好的吸濕性能，吸濕率可達(dá)29.00%，在樣品和對(duì)照品當(dāng)中僅次于Gly。

2.6 紫球藻多糖樣品保濕活性的測(cè)定

紫球藻多糖及其降解產(chǎn)品的保濕效果如圖8所示。

圖8 多糖及其降解產(chǎn)品保濕性能Fig.8 Absorption rate of polysaccharide and the degraded fragments

在環(huán)境溫度為20℃的恒溫條件下，利用干燥器法對(duì)樣品進(jìn)行保濕活性的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多糖樣品及對(duì)照品的保濕率大小順序?yàn)椋篐A＞CTS＞EPS0＞EPS1＞EPS2＞EPS3＞Gly。各樣品的保濕率隨著時(shí)間的減小而減小，其中Gly的保濕性最差，HA的保濕性最強(qiáng)，40 h后保濕率依然高達(dá)86.10%，HA的保濕率略高于CTS，ESPS0的保濕效果也比較好，保濕效果略差于CTS，40 h后CTS的保濕率為78.40%，EPS0的保濕率為77.73%。田大聽(tīng)[18]等對(duì)幾種天然多糖的研究結(jié)果也證明甘油的保濕性能極差與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，造成這種結(jié)果的原因可能是甘油是小分子，在干燥環(huán)境中其小分子結(jié)構(gòu)限制了其與水結(jié)合的能力。本研究結(jié)果表明，4個(gè)不同組分的紫球藻多糖均具有良好的保濕性，三者保濕能力都在40%以上，分別為57.17%、54.85%、45.69%和41.39%。

3 結(jié)論

紫球藻多糖的降解產(chǎn)品EPS2的糖醛酸含量較低為3.05%，ESPS1糖醛酸含量最高，達(dá)11.72%。而ESPS1的總糖含量最高為71.12%，ESPS2的總糖含量相對(duì)較低為68.02%，僅次于ESPS0?？傮w來(lái)說(shuō)各組分的總糖含量相對(duì)較高，均在68%以上。

不同分子量的紫球藻多糖抗氧化能力呈現(xiàn)量效關(guān)系，且與其分子量大小呈負(fù)相關(guān)。同一濃度下，EPS3與對(duì)照組VC的抗氧化接近。在吸濕活性測(cè)定中，EPS0的吸濕率為29.00%，大于CTS和HA的吸濕率，而小于Gly的吸濕率。紫球藻多糖EPS0及其降解產(chǎn)品ESPS1、ESPS2和 ESPS3保濕率分別為 57.17%、54.85%、45.69%和41.39%，都高于甘油，說(shuō)明紫球藻多糖及其降解產(chǎn)品均具有良好的吸濕和保濕性能，且與分子量大小成正相關(guān)。綜上，紫球藻多糖及其降解產(chǎn)品是一種良好的抗氧化及保濕劑，具有廣泛的的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景。

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