綠豆芽中SOD的分離純化、固定化及性質(zhì)研究

梁麗琴，程琳，李繼變，段江燕

（山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041004）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，EC1.15.1.1簡稱SOD）能夠催化超氧化物自由基歧化為O2與H2O，從而防止因超氧自由基在生物體內(nèi)的過多積累而引起疾病或衰老，是一種具有重要生物醫(yī)學意義的金屬酶。據(jù)其活性部位結合金屬離子的不同，目前生物體中已發(fā)現(xiàn)的SOD主要有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD及Ni-SOD4種。

由于動物血液具有疾病多，價格昂貴等缺點，因而以成本低廉，SOD含量豐富且無污染的植物為材料提取SOD勢在必行；水稻、玉米、沙棘、大豆中的SOD提取純化目前已有較全面的研究[1]，而綠豆芽中的SOD提取純化研究則較少；此外，天然SOD穩(wěn)定性差，易失活，不能重復利用，而固定化酶則可克服以上缺點，為此，以綠豆芽為材料提取純化SOD，并對其加以固定化，從而為將SOD更好的應用于食品及醫(yī)藥工業(yè)奠定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

綠豆種子（中綠一號）、牛血清白蛋白、鄰苯三酚、硫酸銨（（NH4）2SO4）、丙烯酰胺（Acr）、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、乙二胺四乙酸（EDTA）、過硫酸銨（AP）、二乙胺基乙基纖維素、考馬斯亮藍（G250）等為分析純。

1.2 主要儀器

TGL-16G-A型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；UV-7504型紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；HD-2001-B-C型核酸蛋白檢測儀：上海嘉鵬科技有限公司；層析實驗冷柜：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DYY-2C型電泳儀及DYCZ-24D型雙垂直電泳槽：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 SOD粗酶液的制備

綠豆用沸水沖洗3次，25℃恒溫箱培養(yǎng)7 d，取去根尖的綠豆胚20 g研磨成勻漿，加30 mL 0.05 moL/L磷酸緩沖液混勻，用四層紗布過濾。濾液經(jīng)高速冷凍離心機離心15min（4000r/min，4℃），上清液即粗提酶液。

1.3.2 SOD酶液的純化

向粗提酶液中加硫酸銨至30%、35%、40%、45%飽和度，混勻，4℃靜置過夜，離心15min（4℃，4000 r/min），取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至80%飽和度，靜置6 h后離心 15 min（4℃，4000 r/min），沉淀用 5 mL 0.025 mol/L pH7.8的磷酸緩沖液溶解。溶解液加入1.25 mL95%冷乙醇和0.75 mL冷氯仿，邊加邊攪拌，10000 r/min離心10 min，取上清液對蒸餾水透析過夜。透析液用聚乙二醇濃縮至一定體積。濃縮液用DEAE-纖維素-32上柱（2 cm×40 cm），用0.025 mol/L pH7.8的磷酸緩沖液洗脫，流速為1.5 mL/管/4 min。以上各步均需測蛋白質(zhì)的含量和酶的活力。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測定

考馬斯亮藍結合法[2]，標準曲線回歸方程：A595nm=0. 0825+0. 0083×蛋白質(zhì)含量

1.3.4 SOD純度的鑒定—PAGE電泳[2]

1.3.5 綠豆芽SOD的鑒定[3]

1.3.5.1 H2O2對綠豆芽SOD活力抑制

取4只潔凈試管，各加入 15%H2O215、20、25、30μL及適量層析SOD酶液，于30℃水浴恒溫30 min，取出迅速冷卻至25℃，測定酶活力，并計算其相對活力。

1.3.5.2 KCN對綠豆芽SOD活力抑制

取6只潔凈試管，各加入10 mmol/L KCN 100、200、300、400、500、600μL及適量綠豆芽SOD酶液。于30℃水浴恒溫30 min，取出迅速冷卻至25℃，測定酶活力，并計算其相對活力。

1.3.6 綠豆芽SOD固定化酶制備[4]

取5支潔凈的小燒杯，按表1加樣并混勻，于4℃冰箱中靜置24 h后即得固定化酶膠體。

1.3.7 綠豆芽SOD活力的測定

1.3.7.1 自由酶活力的測定

鄰苯三酚法[5]（前3 min與時間呈線性關系，經(jīng)計算得鄰苯三酚自氧化速率為0.070 nm/min。）

表1 固定化酶制備加樣表Table 1 The formula on preparation of immobilized superoxide dismutase

1.3.7.2 固定化酶活力的測定

取6支離心管，分別加入pH8. 20.1 mol/LTris-HCl緩沖液 4.5 mL，1 號試管加入蒸餾水 4.2 mL。2、3、4、5、6號試管加入蒸餾水4.1 mL，再分別加入用0.1 mL的游離酶液配制成固定化酶粉末，凝膠濃度分別為17.5%、20.0%、22.5%、25.0%、27.5%，混勻后于25℃預熱20 min。然后分別加入25℃預熱過的鄰苯三酚0.3 mL（在1號管用0.3 mL 10 mmol/L鹽酸代替），開始計時，同時震蕩離心管，準確反應4 min后，立即分別加入1滴8 mol/LHCl終止反應。將6支離心管置離心機中，8000 r/min離心10 min，取上清夜，以1號管為空白管，在420 nm波長處測定其吸光值。

1.3.7.3 洗滌酶活力的測定

將凝膠濃度分別為17.5%、20.0%、22.5%、25.0%、27.5%的固定化酶取出，碎成1 mm見方的小顆粒，裝入層析柱，用少量雙蒸水洗滌3～4次，合并洗滌液，進行酶活力測定，方法同1.3.7.1。

1.3.7.4 固定化結果分析

2 結果與分析

2.1 不同pH磷酸緩沖液對綠豆芽SOD提取結果的影響

不同pH磷酸緩沖液對綠豆芽SOD提取結果的影響見圖1。

圖1 不同pH緩沖液中的SOD活力Fig.1 Activity of SOD in different pH

圖1表明，磷酸緩沖液的pH在7.7～8.0范圍內(nèi)，pH7.8時提取液中SOD的活力最高，當緩沖液中含有0.1 mmol/L EDTA時，溶液中SOD的活力則大幅度升高。因而取0.05 mol/L pH7.8（內(nèi)含0.1 mmol/L EDTA）的磷酸緩沖液來提取綠豆芽SOD。

2.2 不同硫酸銨濃度對綠豆芽SOD純化結果的影響

不同硫酸銨濃度對綠豆芽SOD純化結果的影響見圖2。

由圖2可以看出，用不同濃度的硫酸銨處理綠豆芽上清液，隨著硫酸銨濃度的增大，沉淀去除的蛋白質(zhì)越多，但酶的活力回收也越低，從去雜蛋白和活力回收這兩方面考慮，以40%飽和度硫酸銨最佳，這樣既可以去除更多的雜蛋白又保留較多的酶。

2.1 DEAE-纖維素-柱層析

DEAE-纖維素-柱層析見圖3。

圖3 DEAE-纖維素-柱層析Fig.3 DEAE-cellulose-column chromatography

由圖3可以看出，吸光值曲線有一個高峰和一個小峰，結合抑制率曲線分析可知小峰為雜蛋白。在吸光值曲線高峰管附近選擇酶活力較高的管進行電泳和酶的固定化。

2.4 綠豆芽SOD純化結果

綠豆芽SOD純化結果見表2。

表2 綠豆芽SOD純化結果Table 2 The purified of mung bean sprouts SOD purified

由表2可以看出，粗提液經(jīng)鹽析和層析之后，酶的比活達到4.662×10-5kat/mg，總酶活回收率為43.7%，純化倍數(shù)為26.4。

2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定綠豆芽SOD蛋白質(zhì)純度

聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定綠豆芽SOD蛋白質(zhì)純度見圖4、圖5。

圖4 電泳圖Fig.4 The electrophoretograms

圖5 層析酶的電泳分析圖Fig.5 The electrophoretic analysis chart of purified enzyme

由圖4可以看出，未層析酶的電泳圖中有3條帶，層析酶酶的電泳圖中有2條帶。從有關資料查證純化SOD酶的電泳圖中有2條帶，因而說明層析酶為純化的SOD。由圖5可知，層析酶的電泳圖中有2個遷移率峰，再次說明層析酶已為純化的SOD。

2.6 H2O2和KCN對綠豆芽SOD活力的抑制

H2O2和KCN對綠豆芽SOD活力的抑制見圖6。

圖6 H2O2和KCN對綠豆芽SOD活力的抑制Fig.6 The results of H2O2and KCN in hibiting the activity of mung bean sprouts SOD

由圖6可以看出，采用1.5%H2O2和10 mmol/L KCN作用于綠豆芽SOD30 min（30℃），隨著二者體積的加大，H2O2和KCN對SOD活力的抑制也逐漸增加，當二者體積分別增大至30 μL及600 μL時，綠豆芽SOD的相對酶活力分別降低至15%及7%，這說明H2O2和KCN對SOD活力的抑制很顯著。而據(jù)資料[7]顯示，Mn-SOD對氰化物和過氧化氫均不敏感，Cu，Zn-SOD對氰化物和過氧化氫均敏感，F(xiàn)e-SOD對氰化物不敏感，這表明，綠豆芽SOD為Cu，Zn-SOD。

2.7 聚丙烯酰胺凝膠固定化SOD

聚丙烯酰胺凝膠固定化SOD見圖7。

圖7 不同濃度聚丙烯酰胺凝膠固定化SOD活力Fig.7 The activety of SOD immobilized with different concentration of polyacrylamide gelatin

由圖7可以看出，0.1 mL的綠豆芽SOD游離酶經(jīng)固定化后活性下降。其中22.5%的聚丙烯酰胺凝膠作包埋劑時活性較高。這是由于低濃度的聚丙烯酰胺固定化凝膠較稀，網(wǎng)孔較大，經(jīng)水洗時，可能損失較多，故活性喪失較大。而高濃度的聚丙烯酰胺固定化凝膠較硬，不利于催化底物發(fā)生反應，則固定化酶的活性比較小。

采用22.5%的聚丙烯酰胺凝膠固定綠豆芽SOD，對固定化酶及游離酶的活力進行比較，結果如表3所示。

從表3可以看出，固定化酶的結合效率達87.0%，其活力回收率為80.9%。固定化酶的酶活力小于游離酶，其原因可能是酶分子在固定化的處理過程中，空間構象會發(fā)生變化。酶固定化后，其分子的空間自由度受到限制，影響酶分子活性中心對底物的定位作用。對于大分子底物如蛋白質(zhì)等生物大分子，酶反應的空間效應表現(xiàn)的更為明顯。同時因為載體的空隙太小，或者是固定方式與位置不當，給酶的活性部位造成空間屏障。這種空間屏障使酶分子的活性基團不易與底物或效應物接觸，其直接結果是影響固定化酶的活力。

表3 固定化結果Table 3 The results on immobilizing superoxide dismutase

3 結論

1）用pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含EDTA）提取SOD效果較好，可達3.571×10-7kat/20 g綠豆芽。

2）用40%飽和度的硫酸銨處理SOD粗提液，既可以去除更多的雜蛋白又可保留較多的酶，此時SOD的比活為8.301×10-6kat/mg。經(jīng)過進一步透析、DEAE-纖維素-柱層析純化后，酶的純化程度可達4.662×10-5kat/mg蛋白，總酶活回收率43.7%，純化倍數(shù)26.4。

3）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結果分析顯示SOD主要由2個亞基組成。

4）H2O2和KCN對綠豆芽SOD活力的抑制結果說明綠豆芽SOD為Cu，Zn-SOD。

5）包埋劑聚丙烯酰胺凝膠濃度為22.5%時，固定化酶的結合效率達87.0%，固定化酶的活力回收達80.9%。

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