張玉芳，單守水

（1.煙臺(tái)汽車工程職業(yè)學(xué)院，山東煙臺(tái)265500；2.煙臺(tái)大學(xué)，山東煙臺(tái)264005）

脂肪酶能在非水介質(zhì)中催化如三酰甘油酯等水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化以及酯類的逆向合成反應(yīng)，成為一種應(yīng)用最為廣泛的酶類之一[1]。脂肪酶來(lái)源廣泛，其中利用微生物的生長(zhǎng)代謝積累脂肪酶，不僅成本低、易于工業(yè)化生產(chǎn)，而且所得到的脂肪酶制劑產(chǎn)品比動(dòng)植物來(lái)源的同類產(chǎn)品具有更好的應(yīng)用性，比如有著更好的pH、溫度適應(yīng)性，所以成為工業(yè)脂肪酶的重要來(lái)源[2]。目前研究報(bào)道的可以生產(chǎn)脂肪酶微生物大約65個(gè)屬，其中細(xì)菌28個(gè)屬、放線菌4個(gè)屬、酵母菌10個(gè)屬、其他真菌23個(gè)屬[3]。隨著微生物資源開(kāi)發(fā)的深入以及基因工程技術(shù)手段的應(yīng)用，還會(huì)有望不斷挖掘和改造出新的、產(chǎn)脂肪酶性能更好的微生物菌種。

海洋中生物多樣性溫藏著豐富的微生物資源，尤其由于海洋與陸地環(huán)境的巨大差異，人們希望從中找到更優(yōu)秀的產(chǎn)酶微生物并開(kāi)發(fā)利用。本論文以本實(shí)驗(yàn)室從海洋中篩選出的一株產(chǎn)脂肪酶的褶皺假絲酵母為菌種，對(duì)其產(chǎn)脂肪酶條件及所產(chǎn)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了較系統(tǒng)研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究菌種

褶皺假絲酵母，本實(shí)驗(yàn)室從海洋中篩選并保藏。

1.2 培養(yǎng)基配制

種子斜面培養(yǎng)基（g/L）：無(wú)水葡萄糖20，牛肉蛋白胨10，酵母溶解提取物5，瓊脂粉20；

種子擴(kuò)培培養(yǎng)基（g/L）：牛肉蛋白胨10，酵母溶解提取物 5，橄欖油 5，K2HPO42，MgSO40.5；

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 5，橄欖油 5，K2HPO41，MgSO4·7H2O 1，（NH4）2SO430，pH=7.0；

培養(yǎng)基滅菌：121℃、30 min。

1.3 菌株的活化

將實(shí)驗(yàn)室休眠的假絲酵母取出，斜面培養(yǎng)基28℃、72 h活化培養(yǎng)。

1.4 菌種擴(kuò)培

將活化好的斜面菌種接種到50 mL/250 mL的三角瓶種子培養(yǎng)基中，于30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)30 h。檢查正常、待用。

1.5 產(chǎn)酶發(fā)酵

按10%的接種量接入到100 mL/500 mL三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，200 r/min進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，定時(shí)取樣，測(cè)定菌體生物量，離心取上清液測(cè)定脂肪酶的活力。

1.6 粗酶制備

硫酸銨鹽析法制得脂肪酶粗品。

1.7 脂肪酶活力測(cè)定

采用橄欖油乳化法[4]，40℃，pH7.5條件下每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

1.8 菌體生物量測(cè)定

發(fā)酵液 1500 r/min離心，菌體用10 mL去離子水懸浮，以去離子水為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在560 nm測(cè)定發(fā)酵液的吸光度OD560。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)曲線

圖1為假絲酵母的細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)曲線。

圖1 假絲酵母的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線Fig.1 Growth and enzyme production curve of Candida rugosa

從圖1中看出，細(xì)胞從24 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36 h以后轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。脂肪酶活力隨著生物量的增加而增加，細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后酶活力達(dá)到最高，此后隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)有所下降。

2.2 假絲酵母產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.2.1 pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2為不同pH對(duì)產(chǎn)酶效果的影響?？梢钥闯?，當(dāng)pH為7.0時(shí)，發(fā)酵液酶活力相對(duì)較高，酸性和堿性環(huán)境不適合假絲酵母產(chǎn)酶。

圖2 pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on enzyme production

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶量的影響

圖3是不同發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶效果的影響。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of temperature on lipase production

如圖3所示，30℃時(shí)假絲酵母產(chǎn)酶量明顯高于其他溫度條件下的產(chǎn)酶量。說(shuō)明溫度對(duì)產(chǎn)酶效果影響顯著。

2.2.3 接種比例對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖4是不同接種量對(duì)產(chǎn)酶效果的影響。

圖4 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of inoculation level on lipase production

從中看出，接種量對(duì)產(chǎn)酶量有明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，接種量10%時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酶活力較高。

2.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)產(chǎn)酶的影響

針對(duì)三種碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖）的影響研究結(jié)果見(jiàn)表1所示。

以5 g/L蔗糖為碳源，不同類氮源（牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨）對(duì)假絲酵母產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表1 不同碳源及用量對(duì)產(chǎn)酶的影響Table 1 The effect of different and consumption carbon source on lipase production

表2 不同氮源及用量對(duì)脂肪酶產(chǎn)生的影響Table 2 The effect of different and consumption nitrogen source on lipase production

表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，以蔗糖或淀粉為碳源發(fā)酵產(chǎn)生的脂肪酶活相比最高，葡萄糖最差。這與有關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)果相同[5-6]。表2結(jié)果顯示，無(wú)機(jī)氮比有機(jī)氮更加顯著地有利于假絲酵母產(chǎn)酶，假絲酵母產(chǎn)酶選擇硫酸銨為宜。

2.2.5 振蕩頻率對(duì)產(chǎn)酶的影響

以5 g/L蔗糖、10 g/L硫酸銨為碳、氮源，研究不同的震蕩頻率對(duì)不同發(fā)酵濃度下產(chǎn)酶量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5所示。提高震蕩頻率可以提高發(fā)酵液中溶氧量，從而提高產(chǎn)酶量。

圖5 震蕩頻率對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of shaking frequency on lipase production

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定褶皺假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的較優(yōu)條件為：蔗糖5 g/L，橄欖油5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，（NH4）2SO410 g/L，起始 pH為7.0，接種量10%，在30℃、200 r/min下培養(yǎng) 36 h，產(chǎn)酶能力達(dá)到 4351.6 U/mL。

2.3 假絲酵母脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 酶作用的最適溫度

在不同溫度下測(cè)定褶皺假絲酵母脂肪酶粗品的活力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.6 Relationship between temperature and enzyme activity

酶作用最適溫度為30℃～40℃，超出這一溫度范圍，酶活力迅速下降。

2.3.2 酶作用的最適pH

按照酶活力測(cè)定方法，于37℃測(cè)定相同酶液在不同pH條件下的酶活力。結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH對(duì)酶活力的影響Fig.7 Relationship between pH and enzyme activity

此酶的最適作用pH為7.5，在pH 7.3～7.7范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.3.3 金屬離子對(duì)酶活的影響

在酶測(cè)定體系中加入不同濃度的金屬離子，37℃和pH 7.5條件下保持1 h后測(cè)定酶的殘留活力，以原始酶活為100%，結(jié)果如表3所示。

表3 金屬離子對(duì)酶活的影響Table 3 The effect of metal ion on enzyme activity

幾種金屬離子中，Ca2+、Mg2+對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用，隨著Ca2+濃度的增大，酶活先升后降；而Na+對(duì)酶有一定抑制作用。

3 結(jié)論

1）褶皺假絲酵母的最優(yōu)產(chǎn)酶條件

發(fā)酵培養(yǎng)基：濃度45%（蔗糖5 g/L，橄欖油5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，（NH4）2SO410 g/L；

培養(yǎng)條件為：接種量 10%，pH7.0，培養(yǎng)溫度為30℃，200 r/min，發(fā)酵36 h，脂肪酶活力可達(dá)到4351.6g/L。

2）褶皺假絲酵母產(chǎn)脂肪酶的動(dòng)力學(xué)特性

褶皺假絲酵母產(chǎn)脂肪酶在33℃～38℃，pH 7.4～7.6范圍內(nèi)穩(wěn)定，最佳反應(yīng)條件為37℃、pH 7.5；Ca2+、Mg2+對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用，而Na+對(duì)酶有一定抑制作用。

3）金屬離子對(duì)褶皺假絲酵母產(chǎn)脂肪酶活性影響

在幾種金屬離子中，適量Ca2++對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用，而Na+對(duì)酶有一定抑制作用。

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